?Calcein-AM/PI Double Stain Kit

Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒

產品信息

產品描述

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm）。 因其在傳統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發，僅可觀察到死細胞。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據我司優化的實驗體系，96孔板培養體系中分別可以做500次（CAS: 40747ES76）和1000次（CAS: 40747ES80）檢測。

產品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸；

其中A組分和B組分需-20℃避光干燥保存，C組分-20℃保存，經常使用可放在4℃保存。一年有效。

使用方法

1. 工作液的配制

1.1? 1×Assay Buffer（反應緩沖液）的配制

從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH₂O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2? 1×染色工作液的配制

1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30min。

【注意】：第一次使用可對母液進行分裝，以減少反復凍融次數。?

2）取5μl Calcein-AM溶液 (2 mM)和15μl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2μM，PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結果。

【注意】：由于Calcein-AM的穩定性比較差，此染色工作液必須現配現用，并且在當天用完。

2. 染色步驟

2.1 對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為1×10⁵~1×10⁶細胞/ml。

2.4 取100μl染色工作液加入200μl細胞懸液內，混勻，37℃孵育15min。

【注意】：如果需要，可延長孵育時間至30min。

2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發射濾片僅能觀察到死細胞。

【注意】：可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從而制備死細胞；

b) 用0.1-10μM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的最佳工作濃度。

c) 用0.1-10μM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。

注意事項

1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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