自噬是近年來國自然的研究熱點之一，那么自噬究竟是什么，怎么研究？跟小編一起一探究竟吧！
什么是自噬？
自噬 (autophagy)，是細胞中存在的一種非常關鍵的實現細胞本身代謝需要和某些細胞器的更新的機制。在饑餓、能量缺乏等代謝應激條件下，細胞為了自救，會通過自噬來獲得新的能量來源和物質需求以維持細胞穩態。
自噬的分類
根據細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，自噬分為以下幾種。
01 大自噬（macroautophagy）
由內質網、高爾基體或細胞質膜等來源的膜，包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體（autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物；
02 微自噬（microautophagy）
溶酶體的膜直接包裹待降解物，并在溶酶體內降解；
03 分子伴侶介導的自噬（chaperone mediated autophagy, CMA）
胞質內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體中，然后被溶酶體酶消化。
CMA 的底物是可溶的蛋白質分子，在清除蛋白質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。
自噬研究價值？
自噬在機體的生理和病理過程中都能見到，自噬還參與多種疾病的發生和發展。有研究發現，在腫瘤發展的早期，自噬通過減少細胞內的過氧化物來維持細胞內環境的穩定，抑制腫瘤形成。如果自噬功能降低或紊亂，會引發一系列的疾?。淮罅垦芯勘砻?，自噬功能障礙與衰老、腫瘤、神經退行性疾病、心腦血管病、代謝糖尿病和自身免疫疾病的發生發展密不可分。
因此自噬在疾病治療方面有很大的應用前景，可以通過控制自噬過程，來有效清除有害或受損物質、促進細胞凋亡來治療疾病。
自噬該如何研究呢？
LC3全稱MAP1LC3 ，貫穿整個自噬過程，是目前公認的自噬標記物。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產生胞漿定位的LC3-I。
在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）相偶聯，形成LC3-II并定位于自噬體內外膜上。自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產生LC3-I循環利用；內膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導致自噬溶酶體中LC3含量很低。因此，可以通過熒光顯微鏡觀察mRFP-GFP-LC3或GFP-LC3，實現對自噬發生的檢測。
自噬的檢測方法及原理：
1、LC3雙熒光標記法
mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系的出現，將自噬研究帶入了一個新的階段，自噬不再只是指標，而是一種機制，自噬流的順暢與否，對于細胞生理功能的穩定非常關鍵。
觀察自噬流變化的LC3雙熒光標記法，即使用同時帶有RFP和GFP的病毒感染細胞。GFP是酸敏感型GFP蛋白，在酸性環境下GFP會淬滅，而mRFP是穩定的熒光表達基團，不受外界影響。當自噬發生時，可見明亮黃光點，此為被紅光和綠光同時標記的自噬體；當自噬體和溶酶體融合，自噬溶酶體內的pH值降低，使得改造過的GFP蛋白熒光淬滅，只可觀測到紅光。
因此，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻。mRFP是一直穩定表達的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流進程。
吉凱設計的LC3雙熒光自噬系統采用綠色熒光蛋白Sens-GFP和紅色熒光蛋白Stub-RFP，這兩種熒光具有更高的熒光強度，綠色熒光標記Sens-GFP對pH值更為敏感，在自噬溶酶體中淬滅更完全；而且Sens-GFP和Stub-RFP具有更低的細胞毒性，對細胞狀態影響更小。
2、GFP-LC3 單熒光自噬指示體系
利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的原理，開發出GFP-LC3指示技術：無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。但是綠色斑點增多并不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western blot 檢測游離的GFP、p62來驗證。
3、Western Blot檢測LC3的切割
利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE結合轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
4、透射電鏡下觀察自噬體的形成
自噬經歷了三個階段：吞噬泡(phagophore)--自噬小體(autophagosome)--自噬溶酶體(autolysosome)。
透射電鏡下吞噬泡(phagophore)的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬小體(autophagosome)的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(autolysosome)的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。
5、WB檢測自噬底物p62
在自噬體形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶將其降解，所以p62蛋白的表達量與自噬活性呈現負相關。因此，利用Western Blot檢測p62蛋白的表達量也可以評價自噬水平。
自噬的人工干預和調節
正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察。
為了研究自噬，必須對自噬進行人工干預和調節
（一）自噬誘導劑
1）Brefeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
3）Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
5）Rapamycin：最典型最常用的自噬激動劑(最常用)
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
2）Bafilomycin A1：質子泵抑制劑
3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具藥外，一般還可以結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預。
吉凱提供RFP-GFP的雙熒光慢病毒/腺病毒現貨產品，感興趣就前往吉凱商城了解與購買
???????公眾號底部菜單欄【新功能】上線！
病毒實驗幫?
免費在線學習《國自然熱點研究》、《數據庫及軟件操作教程》
一鍵下載《病毒使用手冊》、《高分文獻》
還有不定時的送新書、抽獎活動，趕緊來掃碼關注一波吧