中科項目文章|磷酸化修飾組學揭示效應因子蛋白功能

嗜肺軍團菌是一種可引起非典型肺炎的致病菌。它的主要毒力決定因素是IVB型分泌系統，它向宿主細胞輸送約330種效應蛋白，從而調節各種細胞過程，實現侵染過程。盡管科研工作者付出巨大的努力，仍只有10%的效應因子的作用機制被明確。因此，效應因子的功能研究能夠幫助我們更加深入地了解嗜肺桿菌與宿主相互作用的分子機制。而在本文中，中山大學的研究團隊針對WipA蛋白這個效應因子的功能進行深入的探討。中科新生命十分榮幸參與了酪氨酸磷酸化修飾蛋白質組學分析工作。

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關鍵詞：肌動蛋白聚合；嗜肺軍團菌；磷酸蛋白質組學；WipA

The Legionella pneumophila effector WipA disrupts host F-actin polymerisation by hijacking phosphotyrosine signaling

Cellular Microbiology IF=4.288

技術路線：

探索攻略：

1. WipA的表達、定位和毒性分析

作者構建WipA缺失突變體，通過分析嗜肺軍團菌在體外生長周期中指定時間點WipA的轉錄和翻譯水平，發現WipA可能在嗜肺桿菌感染的傳播和復制階段都起作用。對WipA在哺乳動物細胞中的定位研究發現，WipA存在于細胞核和細胞質中。為了確定WipA在真核細胞中的細胞毒性，以啤酒酵母芽胞桿菌為替代宿主，用半乳糖誘導啟動子表達WipA。結果表明，WipA以酶活性依賴的方式誘導了酵母的生長缺陷。

2. 酪氨酸磷酸蛋白質組分析

為了探索WipA的蛋白功能，研究團隊利用酪氨酸磷酸蛋白質組學分析野生型與突變體軍團菌感染小鼠巨噬細胞，酪氨酸磷酸化水平的系統變化。共檢測到671個蛋白的1123個酪氨酸磷酸化位點，相對于wipA過表達組(Lp02‐ΔwipA‐pWipA)而言，在wipA缺失組(Lp02‐ΔwipA)有44個氨基酸位點的酪氨酸磷酸化水平上調，36個位點下調。

生物信息學分析，以確定嗜肺桿菌感染期間磷酸蛋白質組變化的功能后果和潛在的信號通路。結果表明，WipA可能參與胞吞作用、FcγR介導的吞噬作用、緊密連接和肌動蛋白細胞骨架通路的調節。

3. 組學結果驗證

為驗證組學結果，作者在參與肌動蛋白聚合信號通路中挑選4種差異表達的磷酸化蛋白進行Western blotting分析。結果顯示，與野生型菌株感染細胞相比，挑選的4種蛋白在突變株感染細胞（ΔwipA，ΔwipA‐pWipA和ΔwipA‐pWipA_D180A）中的磷酸化水平相對較高，表明WipA降低肌動蛋白聚合相關蛋白的酪氨酸磷酸化水平。

4. WipA蛋白功能分析

肌動蛋白有兩種形式：G-actin（球狀）和F-actin（絲狀），兩種形式之間的相互轉換是精確調節的。F/G‐actin比率反映了肌動蛋白聚合和解聚之間的平衡。因此，在后續的功能分析中，研究團隊著重研究了目標蛋白對F/G‐actin比率的影響。免疫熒光分析顯示，表達WipA-EGFP的細胞中的f-actin水平明顯低于表達EGFP的細胞。Western blotting實驗結果表明，表達WipA-EGFP的細胞以酶活性依賴的方式顯示出F/G‐actin比率顯著降低?？偟膩碚f，這些數據表明WipA通過降低F/G‐actin比率來抑制F-actin的聚合。

5. WipA作用機制探討

根據之前的文獻報道，LegK2也同樣可以抑制肌動蛋白的聚合。為了確認這WipA與LegK2的功能，研究人員構建了wipA、legK2或wipA/legK2雙敲除菌株。結果表明，嗜肺桿菌的細胞內復制需要WipA和LegK2。

為了明確肌動蛋白聚合情況，研究人員用嗜肺桿菌突變株感染J774A.1細胞2小時，并用蛋白質印跡法分別檢測F-actin和G-actin表達水平。與野生型菌株相比，突變菌株誘導的F/G‐actin比率顯著增加。這些結果表明，WipA的缺失并不會對legK2突變體的肌動蛋白聚合產生進一步的影響。

小結：

在這項研究中，研究者利用磷酸蛋白質組學策略分析WipA靶向的宿主細胞途徑，并挑選一些參與宿主細胞肌動蛋白聚合的差異磷酸化蛋白質作為進一步研究的對象。

Western blotting進一步證實WipA能使一些與肌動蛋白聚合相關的蛋白質去磷酸化。這些實驗證明WipA通過減少感染期間G-actin到F-actin的轉變來抑制宿主F-actin的聚合。

這項研究為WipA介導的宿主肌動蛋白聚合的調節提供了獨特的見解，并幫助我們闡明了L. pneumophila感染的致病機制。

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