◆ 編者按

食管癌是發生在食管上皮組織的惡性腫瘤，在我國的發病率較高。盡管過去幾年食管癌的治療已經有所改善，但死亡率依然很高，所以食管癌的早期診斷對于治療來說至關重要。目前對于食管癌的早期診斷主要集中在基因水平上，但蛋白質是基因的功能執行者，因此在蛋白水平實現對食管癌的早期診斷尤為必要和重要。

2021年8月16日，Nature Communications（IF: 14.919）雜志發表了一篇題為《Large-scale and high-resolution mass spectrometry-based proteomics profiling defines molecular subtypes of esophageal cancer for therapeutic targeting》的研究成果，該研究利用大規模蛋白質組和磷酸化修飾蛋白質組學對食管癌進行了分子分型：低危S1亞型和高危S2亞型，構建了由ELOA和SCAF4組成的診斷和預后模型，同時篩選找到了治療S2亞型食管癌的藥物。該研究為改善食管癌患者的診斷和預后提供了潛在的治療前景。

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【研究材料】

124對食管癌組織和癌旁非腫瘤組織、295例病人的食管癌組織

【技術方法】

蛋白組學（TMT）、磷酸化修飾蛋白組學(label free phosphoproteomics)、免疫組化

【技術路線】

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◆ 主要結果

1. 大規模蛋白組和磷酸化修飾蛋白組分析

作者使用TMT蛋白組學和label free磷酸化修飾組學分別對124對和31對食管癌組織和癌旁非腫瘤組織進行分析，鑒定和定量到的蛋白、磷酸化位點和磷酸化蛋白數量如下表所示（圖1a-1d）。無監督聚類分析和分層聚類結果證明腫瘤樣本能與癌旁非腫瘤樣本顯著分開且無批次效應（圖1e和1f）。對定量蛋白和定量磷酸化蛋白進行亞細胞定位發現，絕大部分蛋白定位于細胞核、細胞膜、細胞質基質、線粒體和胞外空間（圖１g）。

圖1 大規模蛋白組和磷酸化修飾蛋白組分析

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2. 差異蛋白分析和通路分析

根據蛋白組學和磷酸化修飾蛋白組學的結果進行差異分析，得到的顯著差異蛋白和顯著差異磷酸化位點的統計數量如下表所示（圖2a和圖2c）。對顯著性差異蛋白的功能富集分析發現，一些信號通路如細胞周期、DNA修復、免疫應答、上皮間充質轉變在腫瘤組織中上調，而代謝通路、雌激素響應相關的通路下調（圖2e）。磷酸化修飾蛋白組學結果顯示剪接體通路中的蛋白被高度磷酸化（圖2f），具體結果可見圖2h。

作者將蛋白組學結果與之前的基因結果比對，35個已報道的顯著變化基因中的30個在蛋白組學水平被檢測到（圖2i），但基因水平的變化與蛋白水平的變化不完全同步。有些未在基因水平上發生變化的蛋白，在蛋白水平卻發生了顯著變化。蛋白組和磷酸化蛋白組的研究補充了之前基因組研究的不足，有助于從更多角度更加深刻理解食管癌的發病機制。

圖2 蛋白組和磷酸化修飾蛋白組學中顯著變化的蛋白和富集信號通路

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3. 蛋白組學分析將食管癌分為低危S1亞型和高危S2亞型

根據蛋白組學結果中顯著變化的排名前25%的蛋白在無監督聚類分析（圖1e）和分層聚類（圖1f）結果中的分布，作者將食管癌分為兩種亞型：低危S1亞型和高危S2亞型（圖3a和3b），相對于S1亞型，S2亞型的總體生存期和無病生存期都較短（圖3c）。

為了進一步描述這兩種亞型，作者將蛋白組學中全部樣本定量到的蛋白和磷酸化修飾組學中的磷酸化位點分別做了差異分析（圖3e和3f）。S2亞型（vs S1亞型）顯著上調蛋白的富集信號通路（如DNA復制、mRNA加工）與腫瘤組織（vs 癌旁非腫瘤組織）上調蛋白的富集信號通路一致，意味著這些通路的變化最終導致了高危S2亞型的發生（圖3d和3g）。

磷酸化修飾組學中差異蛋白富集的信號通路主要富集在剪切體、有絲分裂信號通路，這與腫瘤組織富集到的信號通路也一致，意味著這些通路的高度磷酸化對于食管癌的起始和發生發揮著非常重要的作用（圖3h）。

圖3 食管癌分子分型的確定

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4. 食管癌中由ELOA和SCAF4組成的亞型診斷模型的確定

為了確定在臨床中能用到的亞型診斷模型，作者將模型的最大數量設置為1、2、3或4進行特征選擇，以ROC曲線下最大面積(AUC)為標準，最終確定出“ELOA,SCAF4”為亞型診斷模型（圖4a和4b）。構建以ELOA和SCAF4為特征的SVM分類模型進行亞型預測，對124例進行蛋白質組學分析的患者，其AUC為0.976（圖4d）。為進一步驗證亞型診斷模型的可靠性，295例病人的食管癌組織樣本進行免疫組化實驗，結果顯示ELOA和SCAF4在S2亞型中的染色明顯高于S1亞型（圖4e和4f）。Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗均顯示S2亞型比S1亞型的總體生存期和無病生存期都較短（圖4g和圖4h）。上述結果均證實亞型診斷模型能精確的預測食管癌亞型。

圖4 亞型診斷模型的確定

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5. 治療S2亞型食管癌藥物的預測和驗證

為找到能治療食管癌病人的藥物，作者首先用腫瘤組織/肺腫瘤組織中顯著差異表達的蛋白與Connectivity Map數據庫中的結果進行比對，篩選到五種藥物。同時為找到更適合S2亞型食管癌治療的藥物，作者選擇在S1和S2亞型中均差異表達的蛋白且與總體生存期顯著相關的蛋白與Connectivity Map數據庫中的結果比對，初篩到六種藥物(圖5a)。將六種藥物在六種食管癌細胞上進行驗證，發現這六種藥物在六種癌細胞中均發揮了抑制其增殖的作用，且以G28510、Menadione和Sulconazole的作用尤為明顯（圖5c）。克隆形成實驗（圖5d）和動物實驗（圖5e-5h）也證明了三種藥物的有效性。

為驗證這三種藥物對細胞增殖的影響是否與它們對S1和S2亞型差異表達蛋白的調控有關，作者使用蛋白組學的方法進行了驗證，結果顯示三種藥物均在S1、S2亞型中差異表達的蛋白上發揮了調控作用（圖6a-6b）。綜上所述，G28510、Menadione和Sulconazole這三種藥物可用于S2亞型食管癌病人的治療。

圖5 藥物的預測和驗證

圖6 藥物對S1、S2亞型差異表達蛋白的調控

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腫瘤的分子分型即通過NGS、蛋白質組等組學技術，對腫瘤進行分子譜的系統描繪，并根據分子特征譜，進行腫瘤的精準分類及精準診療研究。現在分子分型已成為國家精準醫療戰略的重點研究投入方向，目前也備受CNS頂刊雜志青睞。

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