在上一篇文章《活體成像技術應用之實驗方法選擇》中介紹了活體成像技術的實驗方法主要包括生物發光(bioluminescence)和熒光(Fluorescence)兩種技術。生物發光技術是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或者DNA，而熒光技術則是應用熒光蛋白(如GFP,RFP等)對細胞或者DNA進行標記。

文章發出之后，得到了很多老師的一些反饋意見。其中有一位老師對于使用GFP熒光蛋白進行成像給出了一些建議，這位老師這樣說到：活體熒光成像由于觀測位置和深度不一樣，激發光和發射光均非常容易收到組織吸收。而GFP這類短波熒光蛋白在進行體表淺層成像的效果還可以，但是深層臟器是非常不推薦的。收到老師的意見后，我們在文章《活體成像技術應用之實驗方法選擇》后面及時增加了相關補充說明，供老師們綜合考慮選擇。

確實如這位老師所說，哺乳動物組織的透明度是由血紅蛋白和黑色素的特性決定的，它們可以吸收650nm以下的大部分光，而水會吸收900nm以上波長的光。換句話說，650 nm至900 nm之間的波長將基本上不受阻礙地穿過動物和人體組織。因此對于深層臟器成像觀察，可以考慮使用近紅外熒光蛋白(nearinfraredfluorescent protein，iRFP)，原因是iRFP的最大激發和發射波長分別為690 nm和713 nm。

吉凱基因提供帶有luciferase, GFP, iRFP等不同報告基因的慢病毒工具，各位老師可以根據需求及儀器情況選擇合適的慢病毒進行成像觀察。簡單來說，可以使用GFP可進行活體觀察或者常規顯微鏡觀察；使用luciferase或者iRFP可進行非侵入性生命成像。具體的：

1、 luciferase, GFP, iRFP推薦用于小動物活體成像研究，但是熒光蛋白不建議用于整個小動物的成像；

2、 如果您需要檢測盡可能少的細胞，例如識別逃避治療的少量腫瘤細胞，請選擇高度敏感的報告基因。 在小鼠和小型動物中，luciferase（生物發光）具有出色的敏感性；

3、 如果您需要區分不同的腫瘤結節或精確定位溶瘤病毒感染的腫瘤區域。GFP可提供最高的分辨率，但僅限于動物的非常有限的區域；

4、 GFP，iRFP，luciferase在哺乳動物中具有免疫原性，如果您的研究需要免疫功能模型，尤其是縱向研究，建議使用非免疫原性報告基因；

5、 不同報告基因的信號穿透深度不同，在特定器官中，某些報告基因的信號背景可能是問題。比如GFP，由于動物自身發光，導致動物本身會有很高的背景，因此不利于深部組織成像，此時可以考慮使用iRFP，luciferase；

6、 由于成像設備價格昂貴，因此要考慮您所在機構可以使用的成像設備。iRFP，luciferase需要用配有冷卻CCD相機的光學成像儀成像。其他熒光蛋白（例如eGFP，DsRed）也可以使用光學成像儀成像，但是由于背景自發熒光較高，不建議進行動物整體成像；

7、 對于使用iRFP和其他熒光蛋白進行成像，需要確認設備是否具有所用特定熒光蛋白所需的必要的激光/光源和濾光片組；

8、 熒光蛋白（包括iRFP）的成像不需要其他試劑，而luciferase成像需要底物d-luciferin；

參考文獻：

1. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Filonov et al (Nat Biotechnol. 2011 Jul 17. doi: 10.1038/nbt.1918.)

2. Noninvasive, infrared monitoring of cerebral and myocardial oxygen sufficiency and circulatory parameters. Science 198, 1264–1267 (1977)