酵母裂解酶 20T來自藤黃節桿菌

Zymolyase 20T From Arthrobacter luteus

簡述：

???Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過Arthrobacter luteus(藤黃節桿菌)深層培養獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細胞細胞壁。該制劑是利用硫酸銨對培養液的鹽析作用獲得的凍干粉，其酶活單位是20,000 單位/g.其中主要負責裂解活酵母細胞的酶成分是?-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過對?-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產物主要是昆布五糖。

產品說明：

單位定義：800nm條件下菌液吸光度下降30%，表示一個活力單位。

特異性：此產品的裂解譜包括以下屬的微生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于細胞裂解、原生質球形成及葡聚糖水解。

說明:酵母細胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長階段及培養條件而改變。

聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注冊商標。存：

儲存:凍干狀態于2-8°C中保存，若30°C下放置3個月約失去70%活力。

外觀:凍干粉

活力：20,000單位/g

核心酶：?-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ?-1,3-葡聚糖酶，約1.5 x 10⁶單位 /g

???????? 蛋白酶，約1.0 x 10⁴單位 /g

甘露聚糖酶, 約1.0 x 10⁶單位 /g

?淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未檢出）

催化劑：二硫蘇糖醇（DTT）, ?-巰基乙醇及其他的巰基化合物（如半胱氨酸）

最適pH及溫度：

???? pH 7.5, 35°C裂解活酵母細胞

???? pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范圍：pH 5-10間保持穩定

熱穩定性：60°C，5min喪失細胞溶解能力

警告：使用非**纖維濾器過濾除菌

原生質球制備程序：

1.???? 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養物；

2.???? 收集離心沉淀物（酵母細胞）并記錄濕重；

3.???? 用TE緩沖液懸浮細胞，加入量為1.4ml/g濕重細胞；（TE緩沖液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）

4.???? 雙蒸水快速定容，終體積量為3.5ml/g濕重細胞；

5.???? 按照17.5 ul (總體積的1/200)/ g濕重細胞的量加入? -巰基乙醇（MP 806445），目的是為了除去細胞外層中的甘露聚糖層；

6.???? 30°C輕搖溫育混合液，處于對數期生長的培養物處理15min，處于穩定期生長的培養物處理45min；

7.???? 室溫條件，5000rpm離心5min；

8.???? 用S緩沖液重新懸浮細胞，加入量為4.0ml/g濕重細胞；（S緩沖液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5）

9.???? 5000rpm離心5min；

10.? 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）懸浮細胞，另外加入Zymolyases（50U /g濕重細胞）；如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液，則添加250ul即可。最好根據實驗情況最先優化酶使用量。

11.? 30°C輕搖溫育混合液30min，根據以下方式監測原生質球形成程度：

（1）?????? 加1ul樣品到20ul S 緩沖液內，原生質球應該保持完整；

（2）?????? 加1ul樣品到20ul雙蒸水中，原生質球應該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個樣品的形態差異。

12．一般情況下反應45-60min，原生質球的形成量>90%，此時4^oC下離心收集細胞，5000rpm，5min；

13. 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）懸浮原生質球，5000rpm離心5min；重復此步驟做第二次清洗；；

14.原生質球離心沉淀物-70^oC凍存。

裂解原生質球獲取細胞核：

???溫和的裂解原生質球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll（MP 160003）溶液懸浮細胞離心沉淀物，Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl₂ (MP 195088)的10 mM PIPES 緩沖液內，pH 6.5。

酵母菌基因組DNA的制備：

?以下步驟快捷，適合于從少量酵母培養物中制備基因組DNA ：

1.???? 將過夜培養的10ml酵母菌培養物離心收集細胞，加入280ul TE Buffer（配方見原生質球制備程序中的步驟3），300 ul雙蒸水，3 ul ? -巰基乙醇（MP 806445）；

2.???? 30^oC溫育45min；

3.???? 以臺式離心機的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀物用500 ul S 緩沖液（配方見原生質球制備程序中的步驟8）懸浮.；再次離心棄上清；

4.???? 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S緩沖液懸浮細胞沉淀物（或者使用自己認為最合適的酶濃度）；

5.???? 30^oC溫育1小時；

6.???? 重復步驟3；

7.???? 用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 緩沖液懸浮細胞沉淀物；

8.???? 37^oC溫育3小時，不時的混勻溶液；

9.???? 調水浴鍋的溫度至65^oC，并溫育20min；

10.? 從水浴鍋內取出并冷卻至室溫；

11.? 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內取出并保留上清液；

12.? 用200ul氯仿萃取上清液，之后重復漩渦混勻及離心；

13.? 加入500ul95%乙醇到上清液內，20^oC沉淀10min；

14.? 4^oC下，15,000 xg離心20 min；

15.? 自然風干或者于真空離心蒸發濃縮器內晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA;

16.? 37^oC溫育1小時；

17.? 重復步驟11和12；

18.? 加入2.5倍體積的95%乙醇，20^oC沉淀10min；

19.? 30ul雙蒸水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A₂₆₀，根據消光系數計算DNA產量；

20.