在探索生物系統(tǒng)復(fù)雜性的研究中，空間蛋白組學(xué)在揭示復(fù)雜組織的組織方式方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，近期，Nature Methods將空間蛋白組學(xué)評(píng)選為 2024 年度技術(shù)。空間蛋白組學(xué)涵蓋多種技術(shù)，主要目的是基于不同的檢測和分析方式來揭示組織中蛋白靶標(biāo)的定位、細(xì)胞類型的組成和空間組織信息等。其中常用的一類空間蛋白組學(xué)是基于免疫組化/熒光原理的技術(shù)，包括CycIF、PhenoCycler-Fusion（CODEX升級(jí)版）、IBEX、MIBI和IMC。這些方法可以在同一張組織切片上實(shí)現(xiàn)超多重蛋白的檢測，生成高分辨率的空間圖像，揭示復(fù)雜的細(xì)胞組成及空間位置信息。
尤其是在腫瘤研究中，這些多重成像可通過檢測大量蛋白靶標(biāo)來識(shí)別腫瘤中的細(xì)胞表型，包括細(xì)胞類型、亞型和功能狀態(tài)。例如，在多種癌癥中對(duì)免疫細(xì)胞景觀進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞組成與腫瘤特征的相關(guān)性。腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基質(zhì)相互作用，通過這些多重蛋白成像可評(píng)估細(xì)胞-細(xì)胞之間相互作用可能性，包括同型和異型細(xì)胞間的相互作用。例如，在乳腺癌、肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞間多為同型相互作用，而異型相互作用如腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的相互作用對(duì)腫瘤功能有重要影響。腫瘤具有多種空間模式，從細(xì)胞局部聚集到空間大的區(qū)域結(jié)構(gòu)，這些模式可以影響細(xì)胞間通訊。例如，通過不同的空間分析方法，確定細(xì)胞類型的分布、細(xì)胞互作的空間分布、定義局部富集模式等，發(fā)現(xiàn)空間模式與腫瘤預(yù)后、免疫細(xì)胞分布等的相關(guān)性。
丨 接下來帶你快速了解不同的空間蛋白組技術(shù)原理：
基于質(zhì)譜的檢測方法：如成像質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（IMC）和多重離子束成像（MIBI），可同時(shí)檢測40-50 種蛋白靶標(biāo)。二者依靠質(zhì)譜檢測與抗體偶聯(lián)的金屬同位素，MIBI通過離子束電離，IMC則是激光耦合電離等離子體源來實(shí)現(xiàn)電離。因檢測外源性偶聯(lián)到抗體上的非生物金屬同位素，因此可避免熒光和顯色技術(shù)的背景信號(hào)問題。但是兩者相對(duì)較低的掃描速度意味著相較于基于熒光檢測的方法，它們通常用于對(duì)更小組織區(qū)域的成像。
基于熒光檢測的方法：包括多光譜成像和迭代熒光方法。多光譜成像采用計(jì)算方法來分離重疊的熒光團(tuán)發(fā)射光譜，已實(shí)現(xiàn)多達(dá)20種蛋白的成像。例如PhenoImager HT（之前名為 Vectra Polaris）以及較新的Orion都是市面上可買到的多光譜儀器。迭代熒光方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)40–50 個(gè)蛋白靶標(biāo)的熒光成像。其操作是每一輪染色和成像后，進(jìn)行抗體剝離或熒光團(tuán)滅活，然后再進(jìn)行下一輪染色和成像。例如， MxIF采用化學(xué)猝滅實(shí)現(xiàn)熒光團(tuán)滅活，IBEX和MELC通過漂白實(shí)現(xiàn)熒光團(tuán)滅活，而在 t–CyCIF中兩種滅活方式結(jié)合使用。但是這些迭代熒光方法存在不足，實(shí)現(xiàn)高通量檢測所需的時(shí)間很長，其信號(hào)去除過程可能改變組織結(jié)構(gòu)和抗原表位等問題。
基于寡核苷酸標(biāo)記抗體的檢測方法：如由原來的CODEX技術(shù)升級(jí)為現(xiàn)在的PhenoCycler-Fusion（PCF）技術(shù)，該方法需要將抗體與DNA條形碼進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)抗體一次性添加到組織切片上，利用互補(bǔ)探針雜交和剝離方法實(shí)現(xiàn)循環(huán)成像。由于是抗體一次性添加，所以不存在上述迭代熒光方法中反復(fù)剝離和洗脫導(dǎo)致的抗原表位破壞影響抗體結(jié)合的問題。目前已發(fā)表的應(yīng)用PCF技術(shù)的檢測通量最大可實(shí)現(xiàn)多達(dá)101種蛋白的同步成像。Akoya Biosciences 公司目前也推出了60種已驗(yàn)證過的偶聯(lián)抗體組成的檢測panel，基本可滿足廣泛的對(duì)腫瘤微環(huán)境生物學(xué)的研究。除了已經(jīng)驗(yàn)證過的抗體，該技術(shù)可以方便的實(shí)現(xiàn)抗體偶聯(lián)的自主定制化。相比MIBI和IMC，PCF更適用于大片成像，或許更能全面的分析復(fù)雜的組織空間關(guān)系。
| 空間蛋白組圖像和數(shù)據(jù)分析
空間多重成像技術(shù)通過揭示細(xì)胞多樣性和相互作用改變了組織生物學(xué)的研究模式，但對(duì)其海量數(shù)據(jù)集的分析仍存在瓶頸。當(dāng)前的分析流程可以概括為圖像采集后處理，包括圖像配準(zhǔn)和校正（如通道串?dāng)_、背景、噪聲等）；細(xì)胞分割：借助不同算法，基于大量整理的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集；細(xì)胞特征量化與分類：量化蛋白質(zhì)平均強(qiáng)度生成單細(xì)胞數(shù)據(jù)表，再通過多種方法分類，包括基于譜系蛋白標(biāo)志物的過濾、門控、無監(jiān)督聚類、監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)建模；細(xì)胞表型分析：識(shí)別細(xì)胞類型相關(guān)功能蛋白并進(jìn)一步分類（如耗竭 T 細(xì)胞）；空間分析：探索細(xì)胞間相互作用、定義微環(huán)境、分割微解剖結(jié)構(gòu)并進(jìn)行患者分層以獲取臨床見解。
當(dāng)前的分析流程也存在很多挑戰(zhàn)。圖像二維性使分割算法在重疊或密集區(qū)域易出現(xiàn)細(xì)胞誤分類或遺漏。雖然新的細(xì)胞注釋方法不斷涌現(xiàn)，但尚無方法能夠整合空間數(shù)據(jù)和已有知識(shí)框架下同時(shí)解決重疊細(xì)胞的挑戰(zhàn)。另外分割的深度學(xué)習(xí)模型依賴大量高質(zhì)量訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，而目前缺乏多樣化的可靠的真實(shí)數(shù)據(jù)，基于聚類的標(biāo)簽不理想也會(huì)影響預(yù)測準(zhǔn)確性。當(dāng)前流程碎片化，錯(cuò)誤易在步驟間累積，缺乏數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、分析工作流程和可視化軟件的集成，導(dǎo)致研究者需在不同軟件和分析腳本間切換，不便于整合不同數(shù)據(jù)集信息。
雖然空間圖像分析面臨挑戰(zhàn)，但借助AI系統(tǒng)集成分析與可視化、構(gòu)建無縫集成從圖像低階處理到空間分析各階段的模型、適應(yīng)多樣數(shù)據(jù)集的智能算法及足夠計(jì)算基礎(chǔ)設(shè)施將助力突破，未來有望在空間生物學(xué)等領(lǐng)域取得新發(fā)現(xiàn)。
重點(diǎn)推薦：PCF空間單細(xì)胞蛋白組
相比其他空間蛋白組技術(shù)，PCF空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)展現(xiàn)了多方面的優(yōu)勢：（1）單細(xì)胞分辨率，可精確到250nm/piexl；（2）全片掃描，最大成像面積18mm X 35mm；（3）抗體一次性雜交，減少反復(fù)洗脫帶來的實(shí)驗(yàn)誤差；（4）樣本兼容性高，新鮮冷凍切片和石蠟包埋組織切片均適用 ；（5）使用靈活, 既有商品化抗體Panel，也可定制化檢測；（6）檢測速度快，1分鐘成像100多萬個(gè)細(xì)胞。PCF空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用場景非常廣泛，目前已經(jīng)應(yīng)用在腫瘤微環(huán)境研究、組織炎癥研究、以及胃腸道、神經(jīng)、腎臟等其他組織結(jié)構(gòu)的研究中。借助PCF技術(shù)強(qiáng)大的組織空間數(shù)據(jù)分析和挖掘能力，很多研究成果發(fā)表在Cell、Nature、Science等國際頂級(jí)期刊上。
總結(jié)與討論
目前空間蛋白組學(xué)研究已深入分析生物學(xué)機(jī)制，可分析大量患者隊(duì)列，揭示了細(xì)胞群體和多細(xì)胞空間關(guān)系可作為藥物靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。空間蛋白組學(xué)將變革生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化研究，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。對(duì)大量含臨床數(shù)據(jù)的人體組織樣本進(jìn)行空間蛋白組學(xué)分析可研究細(xì)胞如何組裝成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間的通信和功能互作關(guān)系，也可揭示高階組織結(jié)構(gòu)對(duì)單個(gè)細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的影響，結(jié)合靶向?qū)嶒?yàn)將揭示生物學(xué)和醫(yī)學(xué)問題背后的細(xì)胞功能模塊。