來自APT客戶發表文章，翻譯后修飾 LC-MS/MS 由中科新生命完成。

Glucose Sensor MdHXK1 Phosphorylates and Stabilizes MdbHLH3 to Promote Anthocyanin Biosynthesis in Apple

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PLoS Genet. 2016 Aug 25;12(8):e1006273. doi: 10.1371

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研究背景

葡萄糖是植物體內重要的調節因子之一，可以誘導蘋果中花青素積累。已有文章報道HXK1（己糖激酶1）參與了葡萄糖的調控過程。本篇文章通過對蛋白質間的相互作用研究解析了MdHXK1調控花青素合成的分子機制。

樣本來源

莖段，來源于‘Gala’ apple； 愈傷組織，來源于‘Orin’ apple (Malus domestica Borkh.)的早期胚胎；蘋果果實，來源于‘Red Delicious’

技術

蛋白互作研究（酵母雙雜交，Co-IP，GST pull-down），LC-MS/MS(shotgun)，蛋白磷酸化位點鑒定，體內體外磷酸化實驗，植物轉基因技術，花青素含量測定

研究結果

1、之前研究表明葡萄糖可以誘導擬南芥中花青素的合成。本文通過誘導莖段培養實驗證明葡萄糖同樣可以引起蘋果中花青素的積累；HXK抑制劑葡萄糖胺（glucosamine）卻可以抑制葡萄糖對花青素的誘導作用，這說明HXK參與葡萄糖對花青素含量的調控過程。

S1 Fig Glucose promotes anthocyanin accumulation in anHXK-dependent manner in apple.

2、MdHXK1作為糖代謝酶還可以通過其催化功能參與生物功能調節作用。本文通過構建MdHXK1的突變體植株（催化功能缺失，參考之前擬南芥中的發現）發現調節花青素的積累主要通過葡萄糖信號途徑，但催化途徑也會有一定的作用（低濃度糖實驗的發現，S3 Fig）。

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Fig 1. MdHXK1modulates anthocyanin accumulation mainly through the glucose signalingpathway.

3、通過Co-IP結合LC-MS/MS實驗篩選與MdHXK1互作的蛋白，共得到164個可能蛋白，其中就包括bHLH型轉錄因子MdbHLH3。

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S1Text Identification ofMdHXK1-interacting proteins in co-immunoprecipitation using an LC/MS assay.

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4、利用酵母雙雜交缺失突變體實驗發現MdHXK1與MdbHLH3互作必需區域： MdbHLH3的C-terminus（MdbHLH3346-709aa）和MdHXK1的hexokinase_2 domain（MdHXK1245-498aa）；之后用Co-IP和GST pull-down實驗確證了MdHXK1與MdbHLH3間的互作關系。

Fig 2. MdHXK1physically interacts with MdbHLH3.

5、Western blotting分析發現葡萄糖可以引起MdbHLH3蛋白磷酸化，之后利用質譜方法尋找MdbHLH3的磷酸化位點：Ser361，通過Westernblotting確定位點的準確性；進一步實驗發現磷酸化程度隨著葡萄糖濃度以及處理時間的增加逐漸增強。

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Fig 3. Glucoseinduces the phosphorylation of the MdbHLH3 protein at the Ser361 site.

6、本文通過比較WT，MdHXK1過表達和基因沉默植株中MdbHLH3磷酸化水平證明MdHXK1參與了葡萄糖誘導的MdbHLH3磷酸化；之后通過體外和體內磷酸化實驗證明MdHXK1催化了MdbHLH3的磷酸化。通過缺失突變體實驗發現MdHXK1蛋白的信號肽和hexokinase_2 domain區域對于MdHXK1的細胞核定位以及磷酸化MdbHLH3是必須的。

Fig 4. MdHXK1mediates the glucose-induced phosphorylation of the MdbHLH3 protein.

7、磷酸化不僅可以增強MdbHLH3蛋白的穩定性，還可以增強其對下游基因的轉錄激活能力。

Fig 5. Phosphorylationmodification stabilizes the MdbHLH3 protein and enhances its binding capacityto the promoters of downstream genes.

8、通過對轉基因植株中基因表達以及花青素含量分析證明MdHXK1可以通過磷酸化修飾MdbHLH3促進花青素的合成。

Fig 6. MdHXK1controls anthocyanin accumulation via MdbHLH3 in apple calli.

9、本文之前的體內實驗均是以蘋果愈傷組織為實驗對象，作者最后在蘋果果實中驗證了他們的結論：MdHXK1通過MdHLH3調控蘋果果實中花青素的積累。

Fig 7. Transientexpression of MdHXK1 and MdbHLH3 via theviral vector-based transformation alters anthocyanin levels in apple fruits.

10、最后是作者給出的調控模型：葡糖糖信號激活MdHXK1，進而磷酸化MdHLH3，激活花青素合成相關基因的轉錄與表達。

Fig8. Model demonstrating that MdHXK1 protein kinase stabilizes MdbHLH3 via phosphorylationto modulate anthocyanin accumulation in response to glucose in apple.

小編心得

本文是一篇非常典型的利用蛋白質組學和修飾蛋白質組學輔助研究蛋白相互作用的文章，于2016年8月發表在PLOSGenetics上。整體思路非常清晰：通過Co-IP結合shotgun技術篩選互作蛋白；利用經典酵母雙雜交、Co-IP以及Pull down驗證互作關系；利用修飾蛋白組學尋找互作引起的蛋白修飾形式及位點，推測互作的生理機制；最后通過構建一系列轉基因植物，檢測多種生理指標，體內驗證互作的生物學意義，非常值得大家借鑒。此外，本文內容非常詳實，工作量很大，蛋白質組學和修飾蛋白質組學的應用極大提高了蛋白和修飾位點篩選的時效性和準確率。

推薦老師另兩篇很贊的文章，大家可以鑒賞一番：

MdSOS2L1 phosphorylates MdVHA-B1 to modulate malate accumulation in response to salinity in apple. Plant Cell Rep. 2016 Mar;35(3):705-18. doi: 10.1007

Overexpression of MdSOS2L1, a CIPK protein kinase, increases the antioxidant metabolites to enhance salt tolerance in apple and tomato. Physiol Plant. 2015 Jun 10. doi: 10.1111

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中科新生命 · 質譜系統解決方案專家
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