免疫調(diào)節(jié)藥物來那度胺(lenalidomide)和泊馬度胺(pomalidomide)是治療多發(fā)性骨髓瘤的高效治療方法。然而，幾乎所有的患者最終都由于獲得性耐藥性而復(fù)發(fā)，只有在一小部分病例中發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致耐藥性的基因改變。
為了確定耐藥性的非遺傳機(jī)制，德國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者治療前和復(fù)發(fā)樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄RNA測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)激酶CDK6在復(fù)發(fā)樣本中高表達(dá)。隨后通過細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物學(xué)上的檢測(cè)，明確抑制劑/靶向降解CDK6與IMiD具有協(xié)同抑制腫瘤的作用，CDK6可作為免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）耐藥多發(fā)性骨髓瘤的用藥靶點(diǎn)。相關(guān)研究成果以“Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma”為題，發(fā)表在Nature Communications（中科院JCR一區(qū)，IF:14.919）上。
1. 蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)組中發(fā)生顯著變化的蛋白
5對(duì)病人治療前（診斷組）和復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)組）的蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測(cè)到6094個(gè)蛋白，復(fù)發(fā)組比診斷組共分析得到顯著上調(diào)的蛋白130個(gè)，顯著下調(diào)的蛋白228個(gè)。前6上調(diào)的蛋白為TRIP13、RRM1、NCAPD2、NCAPH、MORF4L1和 CDK6；前6下調(diào)的蛋白為UPRT、DNAJC1、FCRL2、AUH、HYI和HID1。作者在另一批樣本（4個(gè)首次診斷+9個(gè)復(fù)發(fā)）中對(duì)其中的幾個(gè)上調(diào)蛋白進(jìn)行了WB驗(yàn)證，結(jié)果表明CDK6、TRIP13和RRM1在復(fù)發(fā)組中能更多地被檢測(cè)到。
2. RNA測(cè)序、磷酸化蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組的比較
復(fù)發(fā)組比診斷組的RNA測(cè)序分析到了較少的差異基因。作者將蛋白質(zhì)組學(xué)和RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的相關(guān)性較差，皮爾森相關(guān)性系數(shù)（PCC）較差僅為0.34。在上調(diào)最高的蛋白中，有絲分裂調(diào)節(jié)蛋白TRIP13的RNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性最高(PCC=0.84)，其次是NCAPH（PCC=0.84）和NCAPD2（PCC=0.67）。RRM1和CDK6的RNA與蛋白的相關(guān)性分別為0.6和0.39。
磷酸化蛋白質(zhì)組共檢測(cè)到5698個(gè)蛋白上的24796個(gè)磷酸化肽段。發(fā)生顯著變化的磷酸化肽段，其所屬蛋白大部分均在蛋白質(zhì)組學(xué)中被檢測(cè)到，但僅有15個(gè)位點(diǎn)其對(duì)應(yīng)的蛋白發(fā)生了表達(dá)變化，即大多數(shù)磷酸化水平發(fā)生變化的位點(diǎn)其蛋白表達(dá)水平未發(fā)生變化。
3. CDK6、TRIP13和RRM1的蛋白表達(dá)與CRBN無關(guān)
由于突變、缺失或下調(diào)導(dǎo)致的CRBN-CRL4 E3連接酶功能障礙會(huì)改變多種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系和患者對(duì)免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）的敏感性，因此作者分析了CRBN的表達(dá)。在RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中均未觀察到復(fù)發(fā)組比治療組的改變。在4對(duì)樣本的全外顯子測(cè)序中也未發(fā)現(xiàn)CRBN-CRL4 E3連接酶上的突變，在另一批樣本中也未檢測(cè)到CRBN的表達(dá)變化。同樣，CRISPR/cas9介導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞系中CRBN的敲除并沒有改變CDK6、TRIP13和RRM1蛋白的表達(dá)水平。此外，在患者樣本中也未觀察到基因改變與CDK6、TRIP13或RRM1蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，即CDK6、TRIP13和RRM1的蛋白表達(dá)與CRBN無關(guān)。
4. CDK6蛋白在來那度胺抗性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
作者使用不同濃度的來那度胺(lenalidomide)培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系MM.1S和LP-1。100nM 來那度胺(lenalidomide)培養(yǎng)數(shù)周的細(xì)胞對(duì)來那度胺(lenalidomide)產(chǎn)生抗性，且存在CDK6蛋白水平的升高。這與來那度胺(lenalidomide)治療的骨髓瘤患者的研究結(jié)果高度一致。相比之下，來那度胺(lenalidomide)或蛋白酶體抑制劑短期治療72h后，CDK6沒有升高，甚至發(fā)生了降低，該結(jié)果表明CDK6的表達(dá)不是由藥物直接誘導(dǎo)的。
5. 過表達(dá)CDK6會(huì)降低多發(fā)骨髓瘤對(duì)免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）的敏感性
作者進(jìn)一步驗(yàn)證了CDK6、TRIP13和RPM1與藥物抵抗的因果關(guān)系。過表達(dá)CDK6和RPM1顯著降低多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)來那度胺(lenalidomide)的敏感性。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過表達(dá)酶活喪失的CDK6（K34M）時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞對(duì)來那度胺(lenalidomide)的敏感性并不會(huì)降低，這表明CDK6的作用依賴于它的激酶活性。最后，作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIP13不改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)來那度胺(lenalidomide)的抗性。
6. 抑制CDK6使多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)免疫調(diào)節(jié)藥物敏感
鑒于CDK6在來那度胺(lenalidomide)耐藥患者中表達(dá)上調(diào)，而誘導(dǎo)表達(dá)降低了骨髓瘤細(xì)胞對(duì)來那度胺的敏感性，作者接下來檢測(cè)了CDK6抑制劑帕博西尼（Palbociclib）在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中的作用。帕博西尼對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的抑制只有無或者中等的作用。然而，帕博西尼和免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）泊馬度胺(pomalidomide)聯(lián)合使用具有高度協(xié)同作用，帕博西尼能顯著增強(qiáng)了泊馬度胺的抗多發(fā)性骨髓瘤作用。作者在所有表達(dá)不同水平CDK6的細(xì)胞系中都觀察到了這種效應(yīng)。此外，在CDK6蛋白水平升高的獲得性來那度胺耐藥細(xì)胞以及過表達(dá)CDK6的骨髓瘤細(xì)胞中，帕博西尼處理后均使得細(xì)胞對(duì)于免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）的敏感性恢復(fù)到與原細(xì)胞相似的水平。這些數(shù)據(jù)表明，帕博西尼治療增加了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）泊馬度胺的敏感性。
7. 降解CDK6和IKZF1/3的雙功能PROTACs具有分子內(nèi)協(xié)同作用
接下來，作者使用蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC)技術(shù)在細(xì)胞中特異性降解CDK6或/和KEF1/3后骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況。與帕博西尼的結(jié)果一致，PROTAC介導(dǎo)的CDK6降解降低了一部分細(xì)胞系中多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。VHL型PROTAC CST528與IMiDs具有協(xié)同效應(yīng)，這與使用CDK6激酶抑制劑帕博西尼觀察到的結(jié)果一致。相比之下，IMiDs與CRBN型靶向CDK6的PROTAC(BSJ-03-123)的結(jié)合顯示出拮抗作用，這可能是由于對(duì)CRBN E3連接酶的競(jìng)爭(zhēng)。
作者繼續(xù)檢測(cè)了一種基于泊馬度胺(pomalidomide)的CRBN型PROTAC，YKL-06-102，該P(yáng)ROTAC保留了泊馬度胺的活性，并能有效地誘導(dǎo)CDK6和IMiD新底物IKZF1和IKZF3的降解。YKL-06-102顯著降低了所有10種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的活力，包括那些IMiD敏感性較低的細(xì)胞系。這些結(jié)果表明，同時(shí)靶向CDK6、IKZF1和IKZF3的CRBN型PROTACs通過分子內(nèi)協(xié)同作用在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中可有效地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
知識(shí)點(diǎn)：PROTAC 是一種雜合雙功能小分子化合物，其結(jié)構(gòu)由兩個(gè)配體組成，一個(gè)是泛素連接酶配體，另一個(gè)是與細(xì)胞中目標(biāo)靶蛋白結(jié)合的配體，兩個(gè)配體之間通過 Linker 相連，形成靶蛋白配體-Linker-E3 配體的聚合物。隨后，E3 連接酶給靶蛋白加上泛素化標(biāo)簽，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)大的泛素化水解過程，通過泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白。von Hippel-Lindau (VHL) 型和 Cereblon (CRBN) 型 E3 泛素連接酶復(fù)合體是當(dāng)前兩種在PROTAC中應(yīng)用火熱的類型。
8. 泊馬度胺和帕博西尼聯(lián)合治療的體內(nèi)效果顯著
為了檢測(cè)IMiDs與CDK6抑制劑的聯(lián)合使用在體內(nèi)是否有治療效果，作者構(gòu)建了MM.1S細(xì)胞的小鼠移植瘤模型，并在成瘤后將小鼠隨機(jī)分組進(jìn)行17天的治療。與單獨(dú)接受泊馬度胺或帕博西尼的小鼠相比，聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制能顯著改善小鼠的生存。且停止治療后，腫瘤生長(zhǎng)恢復(fù)，這表明兩種藥物的延長(zhǎng)治療對(duì)防止多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)是必要的。
9. IMiDs和CDK6抑制劑協(xié)同作用不依賴于RB1蛋白
因?yàn)镽B1蛋白是CDK6的底物，因此作者檢測(cè)了CRIPSR/Cas9介導(dǎo)的RB1敲除后，多發(fā)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)于藥物泊馬度胺和CDK6抑制劑帕博西尼單用或聯(lián)用的敏感性。結(jié)果表明，RB1敲除可以影響骨髓瘤細(xì)胞對(duì)帕博西尼（Palbociclib）的敏感性，但不會(huì)影響細(xì)胞對(duì)泊馬度胺和帕博西尼聯(lián)用的敏感性，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)IMiDs的敏感性不依賴于RB1。
10. CDK6抑制反轉(zhuǎn)了復(fù)發(fā)相關(guān)的蛋白特征
作者檢測(cè)了泊馬度胺、帕博西尼和特異性降解CDK6單用或聯(lián)用的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系MM.1S的蛋白組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)特征。蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測(cè)到7460個(gè)蛋白，其中分別有240個(gè)和179個(gè)蛋白在泊馬度胺或帕博西尼單用的骨髓瘤細(xì)胞中差異表達(dá)。而帕博西尼單用的蛋白質(zhì)組學(xué)和特異性降解CDK6的骨髓瘤細(xì)胞的蛋白組學(xué)高度相關(guān)。此外，作者注意到一個(gè)很明顯的蛋白變化模式：在復(fù)發(fā)患者樣本中上調(diào)的蛋白在CDK6抑制或降解后的MM.1S細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)（共17個(gè)蛋白）。同樣的，在復(fù)發(fā)患者樣本中下調(diào)的蛋白在CDK6抑制或降解后的MM.1S細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)（共37個(gè)蛋白）。
11. 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定CDK6的底物
作者分析了CDK6抑制劑帕博西尼處理和CDK6特異性靶向降解的MM.1S細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，以尋找CDK6的底物。共鑒定出2811個(gè)磷酸化肽段，其中96個(gè)蛋白上的122個(gè)磷酸肽在帕博西尼或靶向降解處理3 h后顯著下調(diào)。此外，在帕博西尼處理24 h后，558個(gè)不受整體蛋白水平調(diào)控的蛋白的磷酸化狀態(tài)被特異性下調(diào)(1022個(gè)磷酸化肽段)，其中45個(gè)蛋白與3 h時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果重疊，即這些磷酸化位點(diǎn)從早期時(shí)間開始持續(xù)下調(diào)。鑒定到的磷酸化位點(diǎn)包括已知的CDK4/6底物RB1、RBL1、RBL2和CDKN1A，以及在復(fù)發(fā)樣本中調(diào)節(jié)的一些蛋白(DNTM1、GMPS、KLHDC4、NCAPD2、NCAPH、GLYR1、NOP56)。該結(jié)果提供了CDK6激酶功能和CDK6調(diào)節(jié)蛋白水平之間的功能聯(lián)系。
研究總結(jié)
研究者對(duì)5對(duì)來自多發(fā)性骨髓瘤患者的治療前和復(fù)發(fā)樣本進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析和RNA測(cè)序。這些分析揭示了CDK6在復(fù)發(fā)樣本中的高表達(dá)。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中過表達(dá)CDK6降低了對(duì)IMiDs的敏感性，而通過CDK6抑制劑或蛋白水解(PROTACs)降解CDK6與IMiD具有高度的協(xié)同作用。此外，研究者還對(duì)CDK6抑制劑帕博西尼（Palbociclib）處理和CDK6特異性靶向降解的骨髓瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)CDK6抑制反轉(zhuǎn)了復(fù)發(fā)相關(guān)的蛋白特征且分析得到了一些CDK6的底物。總體，本研究找到了多發(fā)性骨髓瘤的一個(gè)非基因變異的靶點(diǎn)——CDK6，該激酶可作為IMiD耐藥的多發(fā)性骨髓瘤的用藥靶點(diǎn)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
吉?jiǎng)P基因憑借多年在靶標(biāo)篩選及驗(yàn)證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標(biāo)準(zhǔn)化 、工程化 、系統(tǒng)化的GRP平臺(tái)，為中國(guó)研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化。其中，多組學(xué)平臺(tái)包含蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)和單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)：
·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)擁有多臺(tái)timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專業(yè)的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組和Olink蛋白質(zhì)組等檢測(cè)服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效；
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