免疫調節藥物來那度胺(lenalidomide)和泊馬度胺(pomalidomide)是治療多發性骨髓瘤的高效治療方法。然而，幾乎所有的患者最終都由于獲得性耐藥性而復發，只有在一小部分病例中發現了導致耐藥性的基因改變。
為了確定耐藥性的非遺傳機制，德國的研究團隊對多發性骨髓瘤患者治療前和復發樣本進行蛋白質組學、磷酸化蛋白質組學和轉錄RNA測序，并發現激酶CDK6在復發樣本中高表達。隨后通過細胞學和動物學上的檢測，明確抑制劑/靶向降解CDK6與IMiD具有協同抑制腫瘤的作用，CDK6可作為免疫調節藥物（IMiD）耐藥多發性骨髓瘤的用藥靶點。相關研究成果以“Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma”為題，發表在Nature Communications（中科院JCR一區，IF:14.919）上。
1. 蛋白質組學發現在復發組中發生顯著變化的蛋白
5對病人治療前（診斷組）和復發（復發組）的蛋白質組學共檢測到6094個蛋白，復發組比診斷組共分析得到顯著上調的蛋白130個，顯著下調的蛋白228個。前6上調的蛋白為TRIP13、RRM1、NCAPD2、NCAPH、MORF4L1和 CDK6；前6下調的蛋白為UPRT、DNAJC1、FCRL2、AUH、HYI和HID1。作者在另一批樣本（4個首次診斷+9個復發）中對其中的幾個上調蛋白進行了WB驗證，結果表明CDK6、TRIP13和RRM1在復發組中能更多地被檢測到。
2. RNA測序、磷酸化蛋白質組和蛋白質組的比較
復發組比診斷組的RNA測序分析到了較少的差異基因。作者將蛋白質組學和RNA測序結果進行比較，發現轉錄組和蛋白組的相關性較差，皮爾森相關性系數（PCC）較差僅為0.34。在上調最高的蛋白中，有絲分裂調節蛋白TRIP13的RNA和蛋白表達的相關性最高(PCC=0.84)，其次是NCAPH（PCC=0.84）和NCAPD2（PCC=0.67）。RRM1和CDK6的RNA與蛋白的相關性分別為0.6和0.39。
磷酸化蛋白質組共檢測到5698個蛋白上的24796個磷酸化肽段。發生顯著變化的磷酸化肽段，其所屬蛋白大部分均在蛋白質組學中被檢測到，但僅有15個位點其對應的蛋白發生了表達變化，即大多數磷酸化水平發生變化的位點其蛋白表達水平未發生變化。
3. CDK6、TRIP13和RRM1的蛋白表達與CRBN無關
由于突變、缺失或下調導致的CRBN-CRL4 E3連接酶功能障礙會改變多種多發性骨髓瘤細胞系和患者對免疫調節藥物（IMiD）的敏感性，因此作者分析了CRBN的表達。在RNA測序和蛋白質組學結果中均未觀察到復發組比治療組的改變。在4對樣本的全外顯子測序中也未發現CRBN-CRL4 E3連接酶上的突變，在另一批樣本中也未檢測到CRBN的表達變化。同樣，CRISPR/cas9介導的骨髓瘤細胞系中CRBN的敲除并沒有改變CDK6、TRIP13和RRM1蛋白的表達水平。此外，在患者樣本中也未觀察到基因改變與CDK6、TRIP13或RRM1蛋白表達之間的關聯，即CDK6、TRIP13和RRM1的蛋白表達與CRBN無關。
4. CDK6蛋白在來那度胺抗性多發性骨髓瘤細胞中表達上調
作者使用不同濃度的來那度胺(lenalidomide)培養多發性骨髓瘤細胞系MM.1S和LP-1。100nM 來那度胺(lenalidomide)培養數周的細胞對來那度胺(lenalidomide)產生抗性，且存在CDK6蛋白水平的升高。這與來那度胺(lenalidomide)治療的骨髓瘤患者的研究結果高度一致。相比之下，來那度胺(lenalidomide)或蛋白酶體抑制劑短期治療72h后，CDK6沒有升高，甚至發生了降低，該結果表明CDK6的表達不是由藥物直接誘導的。
5. 過表達CDK6會降低多發骨髓瘤對免疫調節藥物（IMiD）的敏感性
作者進一步驗證了CDK6、TRIP13和RPM1與藥物抵抗的因果關系。過表達CDK6和RPM1顯著降低多發性骨髓瘤細胞對來那度胺(lenalidomide)的敏感性。同時作者發現，當過表達酶活喪失的CDK6（K34M）時，骨髓瘤細胞對來那度胺(lenalidomide)的敏感性并不會降低，這表明CDK6的作用依賴于它的激酶活性。最后，作者發現過表達TRIP13不改變多發性骨髓瘤細胞對來那度胺(lenalidomide)的抗性。
6. 抑制CDK6使多發性骨髓瘤細胞對免疫調節藥物敏感
鑒于CDK6在來那度胺(lenalidomide)耐藥患者中表達上調，而誘導表達降低了骨髓瘤細胞對來那度胺的敏感性，作者接下來檢測了CDK6抑制劑帕博西尼（Palbociclib）在多發性骨髓瘤細胞系中的作用。帕博西尼對多發性骨髓瘤細胞的抑制只有無或者中等的作用。然而，帕博西尼和免疫調節藥物（IMiD）泊馬度胺(pomalidomide)聯合使用具有高度協同作用，帕博西尼能顯著增強了泊馬度胺的抗多發性骨髓瘤作用。作者在所有表達不同水平CDK6的細胞系中都觀察到了這種效應。此外，在CDK6蛋白水平升高的獲得性來那度胺耐藥細胞以及過表達CDK6的骨髓瘤細胞中，帕博西尼處理后均使得細胞對于免疫調節藥物（IMiD）的敏感性恢復到與原細胞相似的水平。這些數據表明，帕博西尼治療增加了多發性骨髓瘤細胞對免疫調節藥物（IMiD）泊馬度胺的敏感性。
7. 降解CDK6和IKZF1/3的雙功能PROTACs具有分子內協同作用
接下來，作者使用蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC)技術在細胞中特異性降解CDK6或/和KEF1/3后骨髓瘤細胞的生長和增殖情況。與帕博西尼的結果一致，PROTAC介導的CDK6降解降低了一部分細胞系中多發性骨髓瘤細胞的生長。VHL型PROTAC CST528與IMiDs具有協同效應，這與使用CDK6激酶抑制劑帕博西尼觀察到的結果一致。相比之下，IMiDs與CRBN型靶向CDK6的PROTAC(BSJ-03-123)的結合顯示出拮抗作用，這可能是由于對CRBN E3連接酶的競爭。
作者繼續檢測了一種基于泊馬度胺(pomalidomide)的CRBN型PROTAC，YKL-06-102，該PROTAC保留了泊馬度胺的活性，并能有效地誘導CDK6和IMiD新底物IKZF1和IKZF3的降解。YKL-06-102顯著降低了所有10種多發性骨髓瘤細胞系的活力，包括那些IMiD敏感性較低的細胞系。這些結果表明，同時靶向CDK6、IKZF1和IKZF3的CRBN型PROTACs通過分子內協同作用在多發性骨髓瘤細胞中可有效地抑制癌細胞生長。
知識點：PROTAC 是一種雜合雙功能小分子化合物，其結構由兩個配體組成，一個是泛素連接酶配體，另一個是與細胞中目標靶蛋白結合的配體，兩個配體之間通過 Linker 相連，形成靶蛋白配體-Linker-E3 配體的聚合物。隨后，E3 連接酶給靶蛋白加上泛素化標簽，啟動細胞內強大的泛素化水解過程，通過泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白。von Hippel-Lindau (VHL) 型和 Cereblon (CRBN) 型 E3 泛素連接酶復合體是當前兩種在PROTAC中應用火熱的類型。
8. 泊馬度胺和帕博西尼聯合治療的體內效果顯著
為了檢測IMiDs與CDK6抑制劑的聯合使用在體內是否有治療效果，作者構建了MM.1S細胞的小鼠移植瘤模型，并在成瘤后將小鼠隨機分組進行17天的治療。與單獨接受泊馬度胺或帕博西尼的小鼠相比，聯合治療組對腫瘤生長的有效抑制能顯著改善小鼠的生存。且停止治療后，腫瘤生長恢復，這表明兩種藥物的延長治療對防止多發性骨髓瘤復發是必要的。
9. IMiDs和CDK6抑制劑協同作用不依賴于RB1蛋白
因為RB1蛋白是CDK6的底物，因此作者檢測了CRIPSR/Cas9介導的RB1敲除后，多發骨髓瘤細胞對于藥物泊馬度胺和CDK6抑制劑帕博西尼單用或聯用的敏感性。結果表明，RB1敲除可以影響骨髓瘤細胞對帕博西尼（Palbociclib）的敏感性，但不會影響細胞對泊馬度胺和帕博西尼聯用的敏感性，多發性骨髓瘤細胞對IMiDs的敏感性不依賴于RB1。
10. CDK6抑制反轉了復發相關的蛋白特征
作者檢測了泊馬度胺、帕博西尼和特異性降解CDK6單用或聯用的多發性骨髓瘤細胞系MM.1S的蛋白組學和磷酸化蛋白質組學特征。蛋白質組學共檢測到7460個蛋白，其中分別有240個和179個蛋白在泊馬度胺或帕博西尼單用的骨髓瘤細胞中差異表達。而帕博西尼單用的蛋白質組學和特異性降解CDK6的骨髓瘤細胞的蛋白組學高度相關。此外，作者注意到一個很明顯的蛋白變化模式：在復發患者樣本中上調的蛋白在CDK6抑制或降解后的MM.1S細胞中下調表達（共17個蛋白）。同樣的，在復發患者樣本中下調的蛋白在CDK6抑制或降解后的MM.1S細胞中上調表達（共37個蛋白）。
11. 磷酸化蛋白質組學鑒定CDK6的底物
作者分析了CDK6抑制劑帕博西尼處理和CDK6特異性靶向降解的MM.1S細胞的磷酸化蛋白質組學結果，以尋找CDK6的底物。共鑒定出2811個磷酸化肽段，其中96個蛋白上的122個磷酸肽在帕博西尼或靶向降解處理3 h后顯著下調。此外，在帕博西尼處理24 h后，558個不受整體蛋白水平調控的蛋白的磷酸化狀態被特異性下調(1022個磷酸化肽段)，其中45個蛋白與3 h時間點的結果重疊，即這些磷酸化位點從早期時間開始持續下調。鑒定到的磷酸化位點包括已知的CDK4/6底物RB1、RBL1、RBL2和CDKN1A，以及在復發樣本中調節的一些蛋白(DNTM1、GMPS、KLHDC4、NCAPD2、NCAPH、GLYR1、NOP56)。該結果提供了CDK6激酶功能和CDK6調節蛋白水平之間的功能聯系。
研究總結
研究者對5對來自多發性骨髓瘤患者的治療前和復發樣本進行了蛋白質組學、磷酸化蛋白質組學分析和RNA測序。這些分析揭示了CDK6在復發樣本中的高表達。在多發性骨髓瘤細胞系中過表達CDK6降低了對IMiDs的敏感性，而通過CDK6抑制劑或蛋白水解(PROTACs)降解CDK6與IMiD具有高度的協同作用。此外，研究者還對CDK6抑制劑帕博西尼（Palbociclib）處理和CDK6特異性靶向降解的骨髓瘤細胞的蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學檢測，并發現CDK6抑制反轉了復發相關的蛋白特征且分析得到了一些CDK6的底物?？傮w，本研究找到了多發性骨髓瘤的一個非基因變異的靶點——CDK6，該激酶可作為IMiD耐藥的多發性骨髓瘤的用藥靶點，具有潛在的臨床應用價值。
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