編者按

 四溴鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（TBPH），作為一種新型溴代阻燃劑，是傳統阻燃劑五溴聯苯醚(penta-BDEs)的替代品。作為添加型的阻燃劑，TBPH在生產、使用和廢棄時，不可避免地被釋放進入環境中，對生態環境和人類健康造成潛在的威脅。已有研究表明，許多環境污染物會破壞動物體內的脂質穩態，導致異常的脂質積累，主要是肝細胞中甘油三酯(TG)的積累，并伴隨肝細胞膨脹、炎癥和氧化應激。這些不良反應可能導致肝脂肪變性或從單純性脂肪肝轉變為代謝綜合征的肝臟表現，如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的組織學表型。

今天，我們分享2021年5月由中國科學院水生生物研究所研究團隊發表在《Environmental Science & Technology》（IF=11.4）的一項研究成果，該研究建立了斑馬魚非酒精性脂肪肝模型來驗證暴露于TBPH是否會誘導NAFLD進展及其潛在機制，并進行生化測試、組織病理學觀察和肝臟轉錄譜分析以評估NAFLD易感性。為進一步探索NAFLD發病機制及其潛在毒理學機制，還研究了表觀遺傳修飾(例如DNA甲基化)，研究結果表明，TBPH暴露破壞了斑馬魚的肝臟脂質代謝并誘發了NAFLD。

文章題目

Nonalcoholic Fatty Liver Disease Development in Zebrafish upon Exposure to Bis(2-ethylhexyl)-2,3,4,5-tetrabromophthalate, a Novel Brominated Flame Retardant

雜志：Environmental Science & Technology（IF=11.4）

發表時間：2021年5月2日

作者：周炳升，楊麗華，韓建，李瑞雯等

單位：中國科學院水生生物研究所

01、研究背景

四溴鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(TBPH)是一種新型溴化阻燃劑，是五溴聯苯醚(BDEs)等傳統溴化阻燃劑的替代品，已被列為高產量化學品。在過去十年中，它的大規模使用伴隨著廣泛的污染，導致在室內灰塵、空氣、污水污泥和水生環境中檢測到它的存在。此外，據報道，TBPH在水生食物網中經歷了營養放大，在魚類、海洋海豚和鼠海豚中檢測到高濃度在人類樣本中也檢測到它的存在，如頭發、指甲、血清和母乳。

雖然TBPH已在環境和生物體中被廣泛檢測到，但根據先前的研究，在暴露的生物體(如魚類)中，急性毒性相對較低。然而，TBPH的結構類似于鄰苯二甲酸二(2乙基己基)鄰苯二甲酸酯，一種已知的過氧化物酶體增殖劑和脂質代謝干擾物；因此，TBPH已被證明是過氧化物酶體增殖體激活核受體γ (ppartγ)激動劑。在我們最近對斑馬魚胚胎的研究中，我們觀察到急性暴露于TBPH誘導了脂質儲存的減少，主要以依賴于pparγ的方式，通過促進pparγ啟動子的去甲基化和激發下游參與脂質代謝的基因轉錄。核受體信號在脂質代謝功能障礙中起著至關重要的作用，尤其是PPAR家族。最近有報道稱，表觀遺傳調控，如DNA甲基化，通過干擾脂質代謝在人類肥胖發展中發揮作用。我們假設TBPH破壞代謝處理器，通過PPAR信號導致脂質穩態受損通路；然而，TBPH對脂質代謝的生物學作用仍有待闡明。

據報道，許多環境污染物會破壞動物體內的脂質穩態，導致異常的脂質積累，主要是肝細胞中甘油三酯(TG)的積累，并伴隨肝細胞膨脹、炎癥和氧化應激。這些不良反應可能導致肝脂肪變性或從單純性脂肪肝轉變為代謝綜合征的肝臟表現，如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的組織學表型。環境污染是NAFLD發生的重要危險因素。在動物實驗中，越來越多的證據表明高脂肪飲食(HFD)會加重環境化學物質引起的NAFLD。在過去的幾十年里，超重和肥胖已成為世界范圍內普遍存在的健康威脅，并與NAFLD風險的增加密切相關。

在此，我們的目的是確定暴露于TBPH是否會誘導NAFLD進展及其潛在機制。斑馬魚作為模型生物，在肝臟細胞組成、功能、信號和介導肝臟疾病的細胞過程方面與人類相似，使其成為研究肝臟疾病基本機制的有用系統。斑馬魚被喂食正常飲食(ND)或HFD，并進行生化測試、組織病理學觀察和肝臟轉錄譜分析以評估NAFLD易感性。為了進一步探索NAFLD發病機制的潛在毒理學機制，我們研究了表觀遺傳修飾(例如DNA甲基化)。我們的研究結果表明，TBPH暴露破壞了斑馬魚的肝臟脂質代謝并誘發了NAFLD。

02、研究結果

1. 在2周的暴露期間，沒有觀察到一般的毒性或行為異常。在ND組和HFD組中，TBPH暴露沒有改變體重。

在ND組中，暴露于0.02 μM TBPH對HSI（Hepatosomatic index，肝體指數=肝重/體重*100）沒有影響，但暴露于2 μM TBPH時，HSI相對于溶劑對照組顯著降低。在HFD組中，與溶劑對照組相比，暴露于0.02 μM TBPH和2 μM TBPH時，HSI顯著下降。在ND和HFD組中，與溶劑對照組相比，暴露于2 μM TBPH時，肝臟TG濃度顯著增加(圖1A)。

此外，2 μM TBPH處理后，HFD組TG濃度高于ND組(圖1A)。在暴露于0.2和2 μM TBPH時，ND組肝臟組織病理學分析顯示肝臟脂肪變性和輕度球囊變性(圖1B)，而在HFD組中，發現明顯的球囊變性和肝臟脂肪變性明顯惡化(圖1B)。油紅O染色進一步證實TBPH處理中脂質積累。HFD飼喂組的脂質染色最小，而ND和HFD聯合2 μM TBPH組的脂質積累最嚴重，ND和HFD飼喂的日糧加0.2 μM組的脂質積累中等(圖1C)。

圖1

2. 研究人員測量了肝臟中促炎生物標志物的水平，如TNF-a和IL-6。在ND組中，TBPH處理完全沒有誘導TNF-a和IL-6，而在HFD組中，0.2 μM和2 μM TBPH處理可顯著誘導TNF-a和IL-6(圖2A,B)。此外，在沒有TBPH暴露的情況下，與ND組相比，HFD組的TNF-a和IL-6顯著增加(圖2A,B)。

圖2

3. 在ND組中，SOD活性在暴露于0.02或2 μM TBPH時未受影響，而CAT活性在暴露于2 μM TBPH時顯著增加(圖3A,B)。另一方面，在HFD組中，暴露于0.2 μM和2 μM TBPH時，SOD和CAT活性顯著增加(圖3A,B)。

此外，在0.2 μM和2 μM TBPH處理下，HFD組對SOD和CAT活性的誘導均顯著高于ND組(圖3A,B)。在ND和HFD組中，與溶劑對照相比，在0.02 μM TBPH和2 μM TBPH處理下，GSH-px活性顯著降低(圖3C)。在0.02 μM TBPH和2 μM TBPH處理下，ND組GSH濃度雖小但顯著降低，而HFD組GSH濃度顯著升高(圖3D)。暴露于0.2和2 μM TBPH時，與ND組相比，HFD組的GSH濃度更高(圖3D)。

圖3

4. 為了揭示TBPH誘導魚脂肪變性的機制，采用qPCR方法測定了核受體和脂質代謝的幾個標記物的mRNA水平。

在ND組和HFD組中，與溶劑對照組相比，TBPH處理后PPAR家族成員(包括pparaa、pparab和pparg)的轉錄均顯著上調(圖4)。在脂質生物發生和轉運相關基因方面，測定了fabp11a、acaca、fasn、lpl、hmgcra和srebf2的轉錄。在ND組中，暴露于0.2和2 μM TBPH時，fabp11a、acaca、lpl、hmgcra和srebf2的轉錄上調，而fasn的轉錄保持不變(圖4)。同樣，在HFD組中，暴露于0.02 μM和2 μM TBPH時，fabp11a、acaca、fasn、hmgcra和srebf2的轉錄顯著上調，而lpl的轉錄下調(圖4)。

我們還測量了脂肪酸β氧化相關基因的轉錄，如pgcla、cptlaa、cptlab和apoala。在ND和HFD組中，0.2和2 μM TBPH處理后，pgcla、cptlaa、cptlab和apoala轉錄顯著上調(圖4)。

圖4

5. 在ND組中，0.02 μM和2 μM TBPH處理導致tetl和tet2轉錄顯著上調。同樣，在HFD組中，0.02 μM和2 μM TBPH處理導致tetl和tet2轉錄顯著上調(圖5)。根據JASPAR 2020數據，pgcla啟動子上可受DNA甲基化影響的序列中有4個DNA結合位點的轉錄因子，包括3個芳烴受體核轉運子位點和1個轉錄因子AP-2 α位點。

此外，在所選序列中，另一個轉錄因子AP-2a結合位點可受DNA甲基化模式的影響(Supporting Information)。在ND和HFD組中，與溶劑對照相比，0.02 μM TBPH和2 μM TBPH處理顯著降低了pgclo啟動子的DNA甲基化比率(圖5)。

圖5

03、編者點評

總之，TBPH暴露會導致斑馬魚脂肪肝疾病的發展，并導致氧化應激。TBPH暴露破壞了斑馬魚的肝脂代謝，并誘導了非酒精性脂肪肝疾?。∟AFLD）。TBPH暴露還導致DNA去甲基化，并影響肝臟轉錄組。

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！