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活細胞示蹤及常用試劑

細胞染色和示蹤試劑是跟蹤復雜環境中細胞的重要工具，廣泛應用于細胞遷移、創傷愈合及干細胞分化研究。細胞示蹤需要專門的探針染料，必須要對活細胞無毒性，還要同時具有多種熒光顏色可供選擇，以便與不同的儀器激光波長和濾光片匹配，并能與抗體標記或其他細胞分析標記探針共染色。

常用的細胞示蹤染料有以下幾種：

① CMFDA

CMFDA 的英文全稱是5-chloromethylfluorescein diacetate，是一種可自由透過活細胞膜對細胞進行示蹤的熒光染料。

CMFDA是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，FDA）的氯甲基衍生物，具細胞膜滲透性，不具有熒光發光性。當通過被動運輸穿透細胞膜進入活細胞后，CMFDA中的親脂性基團可被胞漿內非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發出綠色熒光， 因帶電荷而不能自由穿透細胞膜，并利用自身氯甲基與細胞內蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巰基轉移酶作用下生成加合物，能完好的保留在胞內。經CMFDA標記的細胞，熒光非常穩定，穩定標記的時間可達數天（至少3天），因此非常適用于細胞分化和形態發生等研究。與常用的鈣黃綠素和FDA相比，具有較長時間的細胞內信號保留特點。

在細胞分裂增殖過程中，CMFDA標記熒光可分配至兩個子代細胞中，且具有不會使鄰近細胞染色的功能（有極少情況下通過細胞間縫隙連接發生染色）。同時，CMFDA標記熒光還主要用于分析細胞間融合、細胞粘附及多藥耐藥轉運蛋白的研究。此外，CMFDA還可用于與其他細胞示蹤染料聯合選擇性標記感染細胞內的病原菌；與膜不通透性核熒光探針共同使用，可用于細胞活性研究。

客戶實例：

CMFDA標記的人臍動脈平滑肌細胞粘付在對齊纖維基質上，纖維硬度增加的原理圖和熒光圖像。

標記類型：huaSMCs（即人臍動脈平滑肌細胞）

標尺: 200μm

引文出處：Bingcheng Yi, Yanbing Shen, Han Tang, Xianliu Wang, Bin Li, and Yanzhong Zhang. Stiffffness of Aligned Fibers Regulates the Phenotypic Expression of Vascular Smooth Muscle Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 6867?6880

② CM-Dil

CM-Dil是DiI的一種衍生物，通過與膜結構的脂質分子結合而標記細胞，適合監測細胞運動以及細胞定位分析。因具有良好的染料維持性，可用以追蹤多次傳代細胞的運動特性。其有著強而穩定的紅色熒光（Ex/Em=553/570nm），與綠色熒光染料以及蛋白具有良好的熒光分辨性，適合做多重指標染色。CM-Dil可自由穿透質膜進入細胞，從而產生不具有膜滲透性的反應產物。經過幾次傳代此染料還可完好的維持在活細胞內，染料隨著細胞分裂傳入子代細胞內，但不會進入相鄰細胞。至少在72小時內保持熒光信號（一般可傳3~6代）。工作濃度下，此染料無細胞毒性，不會影響細胞活力以及增殖能力。

與Dil相比，CM-Dil水溶性更好一些，便于懸浮細胞和固定細胞染色溶液的制備；CM-Dil攜帶的CM基團（即氯甲基替代基團）能與多肽及蛋白上的巰基反應從而使該分子在醛類物質中保持穩定。與其他膜染料如DiI和PKH26不同，一些細胞經CM-Dil染色后，可在后續的固定，透化和石蠟包埋處理中維持穩定的標記，因此特別適用于同時做細胞膜標記以及后續的免疫組化，熒光原位雜交或者電鏡觀察的實驗。

研究證實，CM-DiI標記后熒光在胞內表達穩定，陽性標記率達98%以上，標記細胞形態良好，能有效地觀察細胞在體外的誘導分化情況；或將標記的細胞注入體內，可以有效的顯示移植細胞在活體組織中的遷移及分化。

客戶實例：

外泌體通過CM-DiI孵化進行熒光標記，染料濃度為2μg / ml，37°C,孵育5分鐘隨后4°C，孵育15分鐘。在100 000g, 70分鐘,4°C超速離心移除多余的染料。標記的外泌體(紅色)被纖維蛋白膠包裹。 共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察纖維蛋白膠，Z-Stack掃描檢測分布在凝膠中的外泌體。

激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能，因此，它可以在不損傷細胞的情況下，獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack"模式，即可實現此項功能。

標記類型：外泌體

標尺: 400μm

引文出處：Jiafu Mu, Jiahe Wu, Jian Cao , Teng Ma, Liming Li , Shiqing Feng，Jianqing Gao.Rapid and effective treatment of traumatic spinal cord injury using stem cell derived exosomes.Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 16 (2021) 806–815

③ CFDA, SE

CFDA, SE的英文全稱是Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞示蹤染料，不僅可用于細胞增殖的體外實驗，還可用于追蹤細胞在體內的分裂增殖過程。

CFDA, SE是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，FDA）的衍生物，具細胞膜滲透性，本身不具有熒光發光性。當通過被動運輸穿透細胞膜進入活細胞后，可被胞漿內的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），可發強烈的綠色熒光，不能穿透細胞膜，能完好的保留在胞內。CFSE還可自發性并不可逆地與細胞內的氨基結合從而偶聯到細胞蛋白質上，同時過量且未被偶聯的CFDA, SE通過被動擴散回到細胞外培養基內，被后續清洗步驟所清除。經CFDA, SE標記的非分裂細胞的熒光非常穩定，穩定標記的時間可達數月，因此非常適用于細胞群落分析。

CFDA, SE標記細胞的熒光非常均一，優于以前使用的其他細胞示蹤熒光探針如PKH26，并且分裂后的子代細胞的熒光分配也更均一。在細胞分裂增殖過程中，CFSE 標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，熒光強度變為親代細胞的一半，通過流式細胞儀（FL1通道）根據熒光強度的不同，可檢測出未分裂細胞，分裂一次（1/2的熒光強度），二次（1/4的熒光強度），三次（1/8的熒光強度），以及更多分裂次數的細胞。CFDA, SE可檢測分裂次數多達八次甚至更多。經CFDA, SE標記的細胞可用于體外和體內增殖研究，且具有不會使鄰近細胞染色的功能。CFDA, SE最常用于淋巴細胞的增殖檢測，也可用于成纖維細胞，自然殺傷細胞，造血祖細胞等其他細胞的增殖檢測。

CFDA, SE標記細胞呈綠色熒光，Ex=494nm，Em=521nm，除了流式細胞儀檢測細胞增殖外，還可用熒光酶標板定量活細胞數目，或者用熒光顯微鏡進行均一染色的細胞示蹤觀察。

客戶實例：

人羊膜上皮細胞在體內遷移至損傷的子宮。 用CFSE對人羊膜上皮細胞進行標記后移植到小鼠體內。 綠色熒光染色表達率為100%。

標記類型：hAECs（即人羊膜上皮細胞）

標尺: 100μm

在人羊膜上皮細胞移植到損傷的子宮中3天后，免疫染色顯示出CFSE標記的人羊膜上皮細胞(箭頭所示)，而未進行人羊膜上皮細胞移植的宮腔粘連小鼠未檢測到熒光染色的人羊膜上皮細胞。

標記類型：hAECs（即人羊膜上皮細胞）

標尺: 200μm

引文出處：Boning Li , Qiuwan Zhang, Junyan Sun and Dongmei Lai.Human amniotic epithelial cells improve fertility in an intrauterine adhesion mouse model. Stem Cell Research & Therapy (2019) 10:257

④ CellTrace? Red CMTPX 細胞質紅色熒光探針

CellTrace? Red CMTPX細胞質紅色熒光探針可以輕易穿透活細胞膜進入細胞內，轉變成不具細胞滲透性的反應產物，發出較強熒光信號。隨著細胞的傳代增殖，該染料會轉移到子細胞而非群體中相鄰的細胞中，同時染料熒光信號至少可以保持72 h，該染料顯示出較理想的示蹤性能。CellTrace? Red CMTPX染料表現出無毒、穩定、熒光信號持續時間長，且在生理PH環境中有明亮的熒光特性。此外，染料的激發和發射波長分別是Ex=577 nm和Em=602 nm，發出紅色熒光，可以很好的與發出綠色熒光蛋白GFP一起使用，實現多重熒光檢測。

⑤ Calcein,AM 鈣黃綠素

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光（Ex=490 nm，Em=515 nm）。 因其在傳統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein, AM細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。

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