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為幫助受疫情影響的廣大科研工作者假期科研不中斷，我們從本周一 （3月2日） 起，打造了全新的線上講座單元 — 40分鐘最新頂刊精讀系列，幫助大家在家也能掌握最新研究動態。

第一期講座中，徐恪講師利用40分鐘對CELL上的最新一篇關于肝癌分子分型文章“Integrated Proteogenomic Characterization of HBV- Related Hepatocellular Carcinoma”，從課題設計、文章結構、數據結果及創新點做了精彩的解析（如上圖所示），課后老師們踴躍提問，特別是組學數據分析、文章思路解析以及樣本問題等。小編將問題及回答做了分類匯總，希望對老師們的科研工作有所幫助。

數據分析類

問題1：轉錄組和蛋白組數據的分型結果完全一致嗎？不完全一致的話，作者是如何解決的？

從上圖清晰的看到，對于本文來說，蛋白轉錄層面的分型結果大體一致，但仍然有個別差異。但這并不影響結果的呈現和后續的分析，原因如下：

1). 作者的分子分型最終是按照蛋白組學數據進行的，轉錄（包括TCGA數據庫內公共數據）和磷酸化層面的分型更多為了佐證作者的蛋白層面分型（代謝驅動型、增殖驅動型、微環境失調型）的合理性；

2). 作者直接中根據WES數據庫建立的mRNA-protein對，雖然98.6%呈現正相關，但仍然有部分相關性不高、甚至相反，其中包括的蛋白復合物（RNA聚合酶、呼吸鏈復合物蛋白等）的組裝及其蛋白水解（泛素蛋白酶體激活），所以分型不完全一致也正常，只要解釋合理就好。

問題2：作者為什么分了3型，而不是4型或者更多？

對于分型來說，作者依靠共識聚類策略進行非監督聚類實現。具體到如何確定具體分幾組，一般有兩方面的考量：

1）考慮實際意義：分析分成n個亞組后，是否每一亞組有其特征性的病理機制，其亞組間的預后（或者其他臨床指征）是否有顯著性差異

2）聚類結果分析：主要是這三個圖進行判斷（第一個和第三個圖更重要）：

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l 小圖1：聚類效果最好最穩定的K值是圖中X軸μ值0.1至0.9之間下降坡度最小的曲線

l 小圖3：看輪廓寬度，越接近1，說明組內聚的越好。

樣本問題類

問題1：請問蛋白組學對癌組織或癌旁組織有需要要求嗎，有些癌組織含血量比較豐富，怎么排除剛才徐老師所說的血液干擾？

如果樣本來源于動物模型，我們可以在收樣前進行如下操作，排除血液的干擾：小鼠麻醉固定→橫隔處打開胸廓（暴露胸腔）→保證心臟跳動、迅速剪開右心耳，用注射器從左心室灌注含肝素生理鹽水→灌注到肝腎發白停止灌注。

對于較為珍貴的臨床樣本而言，我們力求在收樣時清洗干凈，去除表面的血污和一些脂肪、結締組織。由于我們所有樣本基本上都是含有血的（組內和組間差異不明顯） 所以對結果不會有特別大的干擾。

問題2：蛋白組學樣本數量最低有要求嗎，做亞型？

目前沒有看到明確的要求規定分子分型的最低樣本數量，但是目前從實際文章看，多數文章的樣本數量>100對（即超過100個病人的癌+癌旁對照）。

在這里，我要跟大家說一個可能的誤區。

比如我們有100對樣本（100個癌組織，100個癌旁組織）。那么，我們在篩選差異蛋白的時候，是用這200個樣本，進行的差異分析。但當我們真正進行分型的時候，是篩選出來的差異蛋白（或變異度 top 50%蛋白），對100個癌組織樣本進行的分型。

所以假如我們樣本數量過少時，就意味著我們可用于分型的樣本會再次減半、影響分型結果。如果需要前期小規模預實驗，建議采取DIA策略，用小樣本評估分型趨勢，后期加大樣本量整合后分析。

PS:只要兩批的QC和實驗條件等保持一致，后期是可以通過生信手段消除批次效應。

研究思路（技術選擇）類

問題1：在翻譯后組學方面，本文為什么選擇磷酸化蛋白組而不是糖基化或者?；揎?？對腫瘤分型，更建議做磷酸化組學嗎？

在本文中，我們可以看到，對于分子分型來說，作者選擇的還是蛋白組學，而不是磷酸化，結果里的轉錄和磷酸化層面的分型，更多的時候是為了佐證蛋白分型的價值。

至于為什么絕大多數頂級期刊選擇磷酸化而不是其他層面，主要是針對潛在藥靶篩選這一后期研究的，其主要原因:1）在所有已知修飾中，磷酸化更常見，涉及的機制更多；2）現在大多數靶向藥物都是磷酸激酶的抑制劑，所以從這個層面也更容易找到合理的現成用藥，提升文章的價值和轉化潛能。

但是，假如我們所關注的疾病，跟其他的修飾關系更大，那么可以將磷酸化換成其他對應的修飾。

問題2：您講得很好。想請教一下，代謝組學可以用于腫瘤分子分型研究嗎？比如從血液樣本篩選特異代謝產物？或者腸道宏基因組學呢？可以用于消化道腫瘤，或者某種上皮癌癥的分子分型嗎？

理論上來說，只要是原位組織樣本，蛋白、修飾、代謝等層面均可進行疾病分型的（Altered metabolism distinguishes high-risk from stable carotid atherosclerotic plaques. European Heart Journal (2018) 39, 2301–2310doi:10.1093/eurheartj/ehy124. 利用代謝組學對頸動脈斑塊進行分型）。

對于血液樣本，不太推薦做疾病分型，對于大多數疾病而言，血液內物質的來源太過復雜 （包括原位組織病理機制下關鍵物質和疾病繼發全身反應導致入血的物質），會對刻畫疾病表型造成干擾。至于腸道微生物樣本，我覺得和血液樣本類似。這兩種樣本能適合進行做標志物類研究，對疾病進行早期預警\預后風險評估。

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