一個基因的表達受多種表達元件調控，有啟動子，增強子/沉默子，5’UTR，3’UTR，轉錄因子，microRNA等，當我們需要驗證其具體功能，如啟動子的活性，5’UTR和3’UTR是否影響基因的表達，轉錄因子對啟動子是激活還是抑制，microRNA在靶基因3UTR上的結合位點，一段特定序列是否有增強子/沉默子功能時，螢火蟲熒光素酶報告基因就是很好的一個用來驗證功能的工具。

今天就以pGL3 promoter和pGL3 Basic兩個載體來簡單說明如何驗證這些表達元件的功能，這兩個載體都帶有螢火蟲熒光素酶報告基因，區別是pGL3 promoter在螢火蟲熒光素酶報告基因上游有SV40啟動子，而pGL3 Basic則只有螢火蟲熒光素酶報告基因。請大家一定要注意待研究元件相對于螢火蟲熒光素酶基因的位置，位置不同，功能不同。

1、 啟動子轉錄活性/轉錄因子結合位點驗證

啟動子轉錄活性對于一個基因表達至關重要，通常做法是：預測啟動子序列，默認取轉錄起始位點上游2000bp作為可能的啟動子，將預測得到的序列構建到pGL3 Basic載體螢火蟲熒光素酶報告基因的上游，通過報告基因判斷啟動子活性。與啟動子形影不離的就是轉錄因子的，轉錄因子對于基因的表達也很關鍵。我們獲得啟動子序列后，需要通過專門的軟件來預測轉錄因子在啟動子區上的結合位點，根據consensus sequence序列進行突變設計，然后通過于突變缺失組對比，判斷轉錄因子的功能以及在啟動子上的結合位點。

2、 microRNA結合位點驗證

對于編碼基因而言，通常認為microRNA是通過結合到編碼基因的3‘UTR來發揮作用。具體做法是：使用專門的網站比如targetscan進行編碼基因于3’UTR結合位點預測，獲得可能的結合位點后，結合位點上下游延伸100bp左右的序列，將序列構建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報告基因下游。根據螢火蟲熒光素酶報告基因判斷microRNA是否對編碼基因有調控作用。一般做法：同時構建結合位點相應的突變型序列質粒，野生型質粒和突變型質粒做對比。

3、 5’UTR和3’UTR功能驗證

對于一個編碼基因，通常都會有5’UTR和3‘UTR，有些編碼基因他們的5’UTR和（或）3‘UTR可能會對基因的表達有影響。5’UTR具體做法是：將編碼基因的5’UTR構建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報告基因的上游，SV40啟動子下游，通過這種結構來判斷5UTR’對基因表達的影響。而對于3’UTR具體做法是：將編碼基因的3’UTR構建到

或者3’UTR構建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報告基因的下游，通過這種結構來預測3’UTR的功能，這里的3’UTR通常都是全長。提供一篇文獻Med Sci (Basel). 2017 Dec 22;6(1). pii: E2.The ODC 3'-Untranslated Region and 5'-Untranslated Region Contain cis-Regulatory Elements: Implications for Carcinogenesis參考。

4、 增強子/沉默子功能驗證

增強子/沉默子功能驗證的通常做法是：將增強子/沉默子構建到pGL3 promoter載體SV40啟動子的上游，如果確實有增強子或者沉默子功能，那就會影響SV40啟動子的活性，通過這種結構來驗證功能。

5、 效應元件(response element)功能驗證

轉錄因子效應元件的序列通常都是很短的一段堿基序列，比如p53效應元件，NFkB效應元件。通常做法是：構建這段序列的多個重復，然后后面接一個miniCMV（minimal CMV (miniCMV) promoter is a low expression synthetic promoter in mammalian cells），然后構建到pGL3 Basic載體螢火蟲熒光素酶報告基因的上游進行功能驗證。

那螢火蟲熒光素酶報告基因還有其他用法嗎？答案肯定是：當然有?。∵@些我認為是比較高大上一些，舉例：

1、 螢火蟲熒光素酶報告基因做示蹤標記干細胞，將目的基因與螢火蟲熒光素酶基因融合融合表達，做成轉基因小鼠，進行干細胞移植。

2、 用螢火蟲熒光素酶報告基因做活體成像來做藥效學評價，特別是在抗腫瘤新藥研究中應用較多。

3、 類似于熒光蛋白，將熒光素酶基因的C端和N端分別連在兩個不同的蛋白質上，若兩個蛋白質相互作用，則用成像技術研究活體動物體內他們的相互作用。