題目：iTRAQ-based Quantitative Proteomics Analysis Identifies Host Pathways Modulated during Toxoplasma gondii Infection in Swine
期刊：Microorganisms
影響因子：4.152
合作技術：PRM定量蛋白質組學
弓形蟲是食源性疾病的主要原因，食用未煮熟的豬肉是感染弓形蟲病的主要危險因素，給社會造成沉重負擔。
在本研究中，作者使用定量蛋白質組學方法來研究弓形蟲感染對豬多種組織蛋白質組的影響。采用串聯質譜法，全面了解蛋白質組的功能和調控。進行了生物信息學分析以鑒定差異表達蛋白（DEP），該蛋白可以在弓形蟲感染的病理生理學中發揮作用。另外，選擇七個DEP用于平行反應監測（PRM）分析，以驗證通過質譜分析獲得的表達結果。
1. 弓形蟲感染的確認
感染組中的所有豬在6 dpi（days post infection [dpi]）時都表現出臨床體征，例如發燒和食欲不振，而對照組中的豬顯然仍然健康。PCR結果顯示，感染組的所有收集組織均為弓形蟲B1基因陽性。而對照組的組織是B1基因陰性的。
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2. 感染組織的蛋白質組學特征
iTRAQ蛋白質組學在豬腦（大腦皮層），肝，肺，腸系膜淋巴結（MLN）和脾臟中分別鑒定了4706、4224、4535、5103和4414個蛋白。在6 dpi時，受感染的腦，肝，肺，MLN和脾臟中的DEPs分別上調了108、125、109、163和140，下調了48、266、61、129和60。在18 dpi時，受感染的腦，肝，肺，MLN和脾臟中的DEPs分別上調了202、171、233、159和141，下調了137、180、250、229和162 （圖1A）。在所檢查的組織組中未發現常見的DEP。為了驗證表達數據，使用PRM進行了靶向質譜分析。脾臟和MLN的七個選定蛋白（HSP90AA1，OXCT1，ARL6IP5，GBP7，GBP1，PDIA3和GVIN2）的PRM表達數據顯示與基于iTRAQ的質譜數據相似的表達趨勢，從而證明了蛋白表達數據的有效性（圖2）。
圖1 差異表達蛋白質（DEP）以及蛋白質表達譜的共表達分析
圖2 iTRAQ與PRM定量比較
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3. 差異表達蛋白質（DEP）的GO和KEGG通路
GO和KEGG對DEP的分析表明，大多數感染組織（包括腦，脾，肺和MLN）的囊泡相關過程均被上調。然而大約190個參與代謝過程的蛋白質在受感染的肝臟中差異表達，其中大多數被下調。這表明弓形蟲感染期間肝臟中存在新陳代謝的下調。在所有受感染的組織中，免疫或感染相關途徑均被上調。這表明抗弓形蟲的機制被激活，其中一些機制在不同組織之間可能很常見，并且對于幫助豬宿主體內抵抗弓形蟲很重要。
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4. 共表達和性狀相關分析
共表達和性狀相關分析可以揭示可能有助于抵抗弓形蟲感染的常見宿主途徑。如圖所示圖1B，被感染組織的蛋白質譜與未感染組織不同，表明被弓形蟲感染已改變了被感染組織的生物學反應。根據蛋白質譜簇樹狀圖，發現了25個蛋白質共表達模塊（圖1C）。模塊，性狀和弓形蟲基因顯著性關系顯示在圖3A，B，我們發現粉紅色模塊與弓形蟲的感染相關性最高。如圖所示3C，對于弓形蟲感染，基因模塊成員與重要基因之間的全局相關系數為0.6，p值為8.1×10 -31。這些數據表明粉紅色模塊中的蛋白質與弓形蟲感染有關。粉紅色模塊包含301種蛋白質。表現出對弓形蟲感染最重要的最高基因的前30種蛋白質包括：HSP90AA1，PLCH1，SERPINA3-3，HSPA4，GBP1，HSPCB，STIP1，TRIM21，HYOU1，HSPA5，ITGAL，PZP，GVIN1，PDIA3，ERAP1，C3， SLA-DRA，LOC100513619，C4，GP91-PHOX，HSPH1，PLG，GBP7，STAT3，CASP1，HSP90B1，HSPA8，PPIB，TAP1和HSP70.2。前30個基因的相互作用網絡顯示在圖3D，如所有這些基因的AUC所示，所有排名前30位的基因均表現出出色的預測弓形蟲感染的能力（圖4）。對粉紅色模塊中基因的KEGG富集分析表明，69條途徑顯著富集（圖5）。
圖3 模塊和弓形蟲感染之間的關系
圖4 ROC分析和AUC
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圖5粉紅色模塊中基因KEGG富集分析
5. 潛在抗豬弓形蟲蛋白的鑒定和功能分析
粉色模塊與弓形蟲的感染高度相關。可以預見的是，具有抗弓形蟲特性的基因應該與弓形蟲的感染高度相關，并在受感染的組織中上調。如圖6A所示，粉紅色模塊中的蛋白質分為上調和下調。我們進一步分析了基因在上調和下調分支中的功能。如圖7所示，下調分支的基因在代謝，細胞遷移或相互作用中顯著豐富。但是，上調分支的基因在免疫或感染相關途徑中顯著富集。因此，上調的分支中的基因被認為是PATP。通過分析豬基因組上的基因分布，我們確定了豬染色體7中的兩個PATP熱點。分布在這兩個熱點中的大多數基因都參與了抗原呈遞或其他與免疫反應相關的途徑。
為了確定已鑒定的PATP的功能，使用CRISPR-Cas9方法構建過表達PDIA3-和HSP70.2的細胞系。我們選擇了兩個高表達的PATP（PDIA3和HSP70.2），它們是前30種蛋白質的中樞蛋白質，用于構建過表達的細胞系。我們的PCR和DNA測序結果表明，PDIA3和HSP70.2過表達已正確插入H11位點（圖6C），盡管僅將HSP70.2插入一個H11等位基因。Western印跡分析表明，HA標記的PDIA3和HSP70.2在兩種過表達的細胞系中正確表達（圖6D）。HSP70.2和PDIA3是抗原呈遞途徑中的兩個關鍵蛋白，并促進由MHC-1復合物呈遞的抗原。如所預期的，與野生型3D4 / 2巨噬細胞相比，HSP70.2和PDIA3過表達的細胞系顯示較低的弓形蟲載量，尤其是PDIA3過表達的細胞。我們的研究還表明，HSP70.2和PDIA3可以達到弓形蟲（圖8），表明HSP70.2和PDIA3可能促進弓形蟲的抗原呈遞，從而有助于限制弓形蟲在宿主細胞內的復制。除了HSP70.2和PDIA3，我們還鑒定了許多其他蛋白，這些蛋白可能具有抗弓形蟲的特性，并且可以揭示體內針對弓形蟲感染的宿主應答新機制。
圖6 粉紅色模塊中的基因和潛在的抗弓形蟲蛋白（PATP）聚集
圖7 對粉紅色模塊兩個分支中的基因進行KEGG富集分析
圖8 與對照（野生型）細胞相比，穩定過表達（OE）HSP70.2和PDIA3基因的轉基因3D4 / 2細胞的免疫熒光分析
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用iTRAQ技術研究了弓形蟲感染過程中豬腦，肝，肺，脾和MLNs的蛋白表達譜。蛋白質組學分析顯示每個受感染組織中的DEP均大于100。免疫反應在所有受感染的組織中均活躍，而在受感染的肝臟中檢測到新陳代謝過程下調，而在受感染的大腦中囊泡介導的轉運上調。使用性狀相關分析，我們確定了25個共表達模塊和許多PATP。我們還證明了過表達兩個PATP（HSP70.2和PDIA3）的豬巨噬細胞顯示出對弓形蟲感染的抵抗力增強。進一步闡明本研究中確定的其他PATP的功能將增進我們對豬抵抗弓形蟲感染的了解。最終，這項工作可以為抗病豬的發展提供堅實的基礎，從而可以減少養豬場中抗寄生蟲藥物的使用。