蛋白磷酸化修飾具有快速、高效和動態變化的特點，其能夠將環境變化和細胞信息關聯起來，從而調控生物學過程。然而，一個刺激或擾動往往引發的成百上千甚至上萬磷酸化位點變化，如何從中識別出能夠發揮功能的磷酸化位點是一個極具挑戰的工作。 2021年12月，來自悉尼大學David E. James、Sean J. Humphrey等團隊，在Nature Biotechnology（IF 54.908）上共同研究發表了“Personalized phosphoproteomics identifies functional signaling”論文，提出了一種“個體化磷酸化蛋白質組學”思路，通過將實驗和計算分析的結合，找到對行為變化及其生物表型背后貢獻最大的磷酸化蛋白及位點。研究以鍛煉后胰島素信號、糖攝入的生理變化為例，利用DDA、DIA磷酸化組學分別用于發現與驗證隊列，全面證明了“個體化磷酸化組學”思路作為通用分析策略，可以揭示復雜生物學過程背后的關鍵信號轉導途徑。 研究材料 發現隊列：5位受試者20例骨骼肌活檢 驗證隊列：10位受試者40例骨骼肌活檢 技術路線 步驟1：“個體化磷酸化組”分析流程的建立與實驗設計； 步驟2：發現隊列：DDA磷酸化蛋白質組發現個體磷酸化呈現特異性特征； 步驟3：個體化磷酸化蛋白質組定義了人群中“不變”與“可變”磷酸化位點； 步驟4：運動重構了人骨骼肌中的胰島素信號； 步驟5：個體化磷酸化蛋白質組學分析優先展示與表型相關的功能性信號通路； 步驟6：驗證隊列：DIA磷酸化組分析確證個體化磷酸化蛋白質組分析結果。 研究結果 1. “個體化磷酸化組”分析流程的建立與實驗設計 經典的磷酸化組學數據分析傾向比較不同處理組間取均值后的差異，這樣僅能發現給定樣本規模中顯著變化的磷酸化差異。本研究則建立了一個“個體化磷酸化組”分析，在行為干預前后對個體獨立進行縱向磷酸化蛋白質組采樣與表型記錄，從而找到對行為變化及其生物表型背后貢獻最大的磷酸化蛋白及位點。 為驗證該思路，本研究通過分析鍛煉引發的胰島敏感性及其糖代謝表型變化背后的磷酸化，找到了與之最緊密關聯的磷酸化位點。實驗設計了DDA磷酸化組分析的發現隊列、DIA磷酸化組分析的驗證隊列。發現隊列中：選取5個受試者進行2.5h單腿伸膝運動，隨后對運動和休息的倆腿肌肉分別活檢取樣，然后進行2h高胰島素正糖鉗夾術方法評價胰島素敏感性和血糖測定，術后再次活檢取樣。
圖1 個體化磷酸化組分析流程的建立與實驗設計
2. 發現隊列：DDA磷酸化蛋白質組發現個體呈現特異性特征
實驗對共計20例活檢樣本進行磷酸化組、蛋白質組分析，共定量到2776個蛋白上超過11000差異磷酸化位點。通過對全部磷酸化數據進行聚類和PCA，發現同一受試者的磷酸化蛋白質組聚集最緊密，表明不同個體的相同組織的基態磷酸蛋白質組呈現獨特的個體化特征。
圖2 磷酸化蛋白質組呈現個體特異性的變化特征
3. 個體化磷酸化蛋白質組定義了人群中“不變”與“可變”磷酸化位點
人群磷酸化蛋白質組變異往往由一系列磷酸化變化驅動。本研究進一步將受試間最大變異系數（CV）≤ 15%的磷酸化位點定義為“不變磷酸化位點”，而任何受試者間變異系數（CV）> 75%的磷酸化位點定義為“可變磷酸化位點”。分析表明，“不變磷酸化位點”富集在細胞周期、細胞凋亡相關蛋白中。“可變磷酸化位點”則具有磷酸化獨特變化，比如ERK2（T185）發生顯著變化，該位點在不同受試者之間變化 90 倍，同時在基態與胰島素注射間變化8倍，表明該位點呈現高度動態變化。
圖3 個體化磷酸化蛋白質組定義了人群中“不變“與”可變“磷酸化位點
4. 運動重構了人骨骼肌中的胰島素信號
進一步對同一受試者不同條件下的個體磷酸化變化進行分析，并將變化磷酸化位點及蛋白整合成為與胰島素信號密切相關的通路圖，其中綠色標注蛋白為KEGG、GO等收錄的胰島素信號相關經典通路蛋白，紫色標注蛋白則為未報道過的非經典胰島素信號相關蛋白。分析發現胰島素激活激酶（如AKT）是整個調控網絡的核心，其信號轉導至更遠端蛋白質以調節關鍵功能，包括參與合成（RPS6、EIF4EBP1、EIF4EBP2）、轉錄（MAF1）、糖酵解（PFKFB2）和 GLUT4轉位等遠端蛋白，而且大部分胰島素調控磷酸化蛋白并非報道的經典相關蛋白。
圖4 運動重構了人骨骼肌中的胰島素信號
5. 個體化磷酸化蛋白質組學分析優先展示與表型相關的功能性信號通路
為找到與葡萄糖攝入緊密相關的目標磷酸化，在磷酸化位點與表型之間建立了嚴格的配對相關標準（Padj < 0.05），從1437條磷酸化肽段中，篩選到了與葡萄糖攝入顯著相關的132條磷酸化肽段。個體化磷酸化蛋白組分析中，篩選的磷酸化位點顯示功能富集程度是所有差異磷酸化的2.6倍。報道的功能位點的百分占比顯著大于測試位點的隨機排列樣本。
圖5 個體化磷酸化蛋白質組學分析優先展示與表型相關的功能性信號通路
6. 驗證隊列：采用DIA磷酸化組分析確證個體化磷酸化蛋白質組分析結果
為了測試個性化磷酸化組分析結果的可重復性，設計了驗證隊列：采集10名新受試者不同狀態下共計40例活檢樣本進行DIA磷酸化蛋白質組分析，定量到23174條磷酸化肽段，在驗證隊列中同樣找到的與葡萄糖攝入相關磷酸化位點中，98%變化一致，75% 顯著相關。此外，在發現隊列找到的8條相關通路中，包括葡萄糖代謝過程、胰島素刺激、糖原生物合成和 TOR 信號等6條均被驗證到。總之，該驗證實驗重復了與葡萄糖攝取相關的功能富集結果。
圖6 DIA磷酸化組分析確證個體化磷酸化蛋白質組分析結果
小結
本研究建立了一個“個體化磷酸化組”分析流程，利用個體表型變異，通過結合實驗和計算分析出與生物學功能聯系最緊密的蛋白磷酸化。利用實驗利用這個方法，分別采用DDA及DIA模式的磷酸化組分析，作為發現與驗證隊列，探索了鍛煉是如何增強人骨骼肌中的胰島素信號，以及其背后關鍵的磷酸化位點，包括在糖代謝中一些蛋白上已知和未知的磷酸化位點等。綜上，這些結果確立了“個性化磷酸化蛋白質組學”作為發現復雜生物學變化背后關鍵信號轉導途徑的通用方法。
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