編者按
今天，我們特別關注一項于2023年發表在《Developmental Cell》的新研究——《A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids》，該研究提出了一種高級別漿液性卵巢癌（HGSC）類器官的建立和長期培養方案，使得類器官建立成功率提高53%。此外，HGSC類器官保留了原始腫瘤的基因組和表型特征，并且類器官藥物反應與臨床結果一致。
一、研究背景
高級別漿液性卵巢癌（HGSC）是最普遍和最致命的卵巢癌（OC）類型，占OC死亡率的70%-80%。HGSC的特點是分子異質性高，僅顯示少數復發性遺傳異常，如TP53功能喪失（91%-96%的患者）或BRCA1 / 2基因突變（20%）。并且在過去的幾十年里，HGSC患者的生存率幾乎沒有改善。
目前，腫瘤細胞減滅術聯合鉑類和紫杉烷類藥物化療仍然是一線治療方案，雖然初始應答良好，但大多數患者仍會復發。PARP抑制劑的引入提高了BRCA1/2突變或DNA雙鏈斷裂修復中其他缺陷患者的總生存期，可作為鑒定患者分層的預測性生物標志物，在HGSC中產生臨床益處。因此，在臨床前模型系統中捕獲HGSC的巨大分子復雜性對于促進發現新的生物標志物和匹配的治療策略至關重要。
患者來源的癌癥類器官，作為能夠自我擴增的三維細胞培養物，與標準細胞系相比，保留了遺傳異質性，并更接近原始腫瘤的形態特征。與患者來源的異種移植物（PDX）相比，它們的成本更低，更易于維持和擴增。近年來，來自OC和其他實體瘤的類器官已被用于分子生物學研究和藥物篩選。然而，類器官構建的成功率因腫瘤類型而異，限制了它們的廣泛可用性。雖然來自許多OC類型的類器官的建立已經成功，但據報道，來自HGSC衍生的類器官培養物的成功率實際上仍然相對較低，只有23%—38%。
此外，HGSC類器官主要由新鮮的手術樣本培養而成，這些樣本只能在有限的時間內存活，并且需要醫院和研究機構之間的地理位置接近以及昂貴的基礎設施。這給HGSC類器官的建立和廣泛可用性帶來了重大限制。因此，需要為HGSC類器官的高效、長期培養設計培養基條件，同時也需要評估它們在基于類器官的功能測定中的相關性。
二、主要研究成果
1、建立HGSC類器官培養基
研究者使用來自腫瘤細胞減滅術、腹腔鏡活檢或腹水引流的癌癥患者樣本，研究關于HGSC類器官培養基的優化和隨后的類器官培養。
本研究采用了Advanced DMEM/F12培養基，并添加了Glutamax、Primocin、N-乙酰半胱氨酸和B27添加劑（“基礎培養基”）。然后，研究者評估了單個培養基添加劑對HGSC原代細胞短期類器官形成和生長的影響。添加成纖維細胞生長因子（FGF）-10，p38抑制劑SB202190或TGF-β受體抑制劑A83-01可改善類器官形成。另一方面，添加EGF、FGF-2或Noggin導致細胞附著增加和類器官形成減少。R-Spondin 1、煙酰胺（1mM）或前列腺素E未引起任何可觀察到的影響。
因此，研究者繼續使用基礎培養基，補充有FGF-10、SB202190和A83-10（培養基0.1;M0.1）進一步優化。本研究還表示添加FGF-4可導致傳代期間類器官形成增加（培養基0.2;M0.2）。在隨后的實驗中，用β-雌二醇補充M 0.2增加了HGSC類器官的形成和生長（培養基0.3;M0.3）。煙酰胺的添加進一步改善了類器官的形成（培養基1;M1）。
原文圖1. HGSC類器官培養基配方的建立
2、兩種培養基配方提高HGSC類器官培養的成功率
有趣的是，當M0.3補充EGF時，研究者觀察到EOC883 _ pAsc 樣本的生長顯著降低并最終導致培養物死亡。與之相反，EGF促進了其他幾個樣本的生長。將表皮生長因子與其他添加劑（包括Heregulin β-1、氫化可的松和Forskolin）結合，進一步改善了這些樣本的生長和擴增。而EOC883_ pAsc生長和類器官形成受到這些添加劑的損害。
這些實驗表明，EGF、Heregulin β-1、氫化可的松和Forskolin的加入可以促進或限制類器官的生長，而這取決于樣品。因此，為了最大限度地提高類器官生長成功的可能性，每個 HGSC樣品應該在兩種不同的培養基中平行培養即M1和培養基2（M2; 補充有Heregulin β-1，氫化可的松和Forskolin）。
該研究通過在M1，M2和以前發表的HGSC類器官培養基中平行培養三個HGSC樣本來測試。正如預期的那樣，EOC883 _ pAsc只能在M1中成功培養。在其他配方中，生長受到抑制，甚至死亡。相反，EOC382 _ pOme可以在M2和其他HGSC類器官培養基中培養。
值得注意的是，在兩種含EGF濃度高于M2的兩種培養基中，類器官的生長加速，表明 EOC382 _ pOme 受益于富含生長因子的培養條件。最后，EOC136 _ pAsc 未能在任何測試的培養基配方中穩定傳代，但在M2中觀察到最大程度的短期生長。綜上所述，這些結果表明，在M1和M2中平行培養HGSC原代細胞能夠成功地從樣品中構建類器官，否則如果使用以前發表的方法培養則會失敗。
Maenhoudt等在22例患者中成功培養了5例不同的HGSC患者（作者定義為> 4次傳代）的類器官，總體成功率為23%。Hoffmann等成功將45例患者中的13例培養成類器官（> 6次傳代），成功率為29%。Kopper等報告了成功構建的類器官，這些類器官未顯示出生長停滯，并且在29例嘗試的患者中，有11例患者至少達到第8次傳代。
研究者使用了更嚴格的標準，并在滿足四個條件的情況下定義為成功的類器官培養：（1）設法將細胞培養至少10代;（2）沒有觀察到樣品生長停滯;（3）擴增樣本中的癌細胞;（4）培養的細胞攜帶與原始樣本相同的TP53突變?？傮w而言，研究者嘗試從19名不同患者的癌癥樣本中培養類器官。使用 M1/M2 方法，對10名患者進行了類器官培養，成功率為 53%。
原文圖2. M1/M2方法提高了HGSC類器官培養成功率
3、建立可擴展的長期HGSC類器官收集系統
本研究總共構建了17例穩定的長期HGSC類器官——M1培養了7種，M2培養了10種。此外，研究者從不同臨床階段采樣的患者中獲得類器官: 化療治療前（n = 8），化療期間（n = 4）和復發期間（n = 5）。并根據國際婦產科聯合會（FIGO）分期診斷抽樣患者IIIC （n = 4），IVA （n = 5）和IVB（n = 1）。
隨后，根據WGS數據，研究者估計了類器官和原始樣本的癌細胞含量。類器官的特點是腫瘤純度高（99.2%±1.1%），與它們來源的原始樣本腫瘤純度（44.1%±29%）相反。HGSC類器官在培養中于患者間和患者內水平均表現出廣泛的形態異質性。例如，EOC677 _ pAsc類器官生長為小的密集聚集體，而 EOC677 _ rAsc和 EOC677 _ r2Asc形成松散聚集的囊狀結構。其他觀察到的結構包括球狀聚集體（例如，EOC172 _ rAsc或EOC733 _ iOme）或大的、不規則的、密集的聚集體（例如，EOC733 _ pPer，EOC1120 _ pOme或EOC1120 _ rAsc）。為了比較類器官與相應患者樣本的表型，研究者進行了蘇木精和伊紅（H & E）和IHC染色。
總的來說，類器官表現出與腫瘤相匹配的上皮細胞的形態特征，包括腺乳頭生長模式和嚴重的（3 +）核多形性。
原文圖3. HGSC 類器官集合概述
4、長期培養的HGSC 類器官保留患者樣本的基因組圖譜
研究者進行了WGS分析，以研究類器官是否重現了原始腫瘤的基因組圖譜。所有類器官模型都含有與在相應腫瘤組織中觀察到的相匹配的TP53突變。值得注意的是，TP53突變的變異等位基因頻率（VAF）在所有類器官培養中均為1，證實類器官僅包含癌細胞。HGSC的其他遺傳畸變特征包括在RB1，CSMD3，CDK12，KMT2B，KMT2C 和CCNA2中，CCNE1，KRAS，MYC和MECOM的擴增和點突變。
一般來說，在原始腫瘤樣本和類器官之間以及在長期傳代過程中，這些細胞是保守的。使用來自同一患者的不同臨床過程階段的樣品使研究者能夠獲得代表腫瘤遺傳進化的類器官。然而，在一些類器官培養物中，觀察到在晚期傳代時出現的新突變，這表明在培養過程中發生遺傳進化或克隆選擇?？偟膩碚f，類器官與原始患者樣本表現出非常高的突變一致性。此外，研究者將特定突變過程相關的突變特征與腫瘤樣本和匹配類器官的突變特征相匹配，發現單堿基替代特征3（SBS3）和小插入和缺失特征6（ID6）在17個患者樣本中的12個中被鑒定出來。值得注意的是，類器官還重現了臨床進展期間SBS3和ID6特征的出現（例如，在患者EOC989中復發時出現的 SBS3特征）。
為了比較類器官和與其匹配的腫瘤的基因組圖譜，研究者進行了拷貝數變異（CNV）分析。類器官在長期傳代過程中維持了原始腫瘤的CNV譜。此外，來自同一患者的不同臨床過程階段的類器官維持了在腫瘤進化過程中獲得的基因組變化（例如，在患者EOC677的第一次復發時獲得染色體7片段）。總的來說，目前的類器官收集重現了病人間的基因組異質性，并準確地反映了疾病的演變。
原文圖4. 用M1/M2培養的HGSC類器官在長期培養中維持了原始腫瘤組織的基因組圖譜
5、HGSC類器官維持了腫瘤的轉錄組學特征
本研究對5名患者的7個類器官樣品和它們來源的腫瘤/腹水材料以及患者EOC883的腫瘤樣品進行了scRNA-seq。
研究者對總共30,492個細胞進行了聚集，得到了26個子群。來自類器官樣本的細胞形成類器官特異性簇，而來自患者樣本的細胞形成多個混合簇。標記物表達分析顯示，混合簇由基質細胞或免疫細胞組成，患者特異性簇由癌細胞形成。然后研究者探討了在腫瘤樣本中被鑒定為患者特異性標志物的基因的表達是否反映在相應的類器官中。他們觀察到 EOC677，EOC540和 EOC883患者的腫瘤樣品和類器官具有非常強的相關性。對于患者，EOC733和EOC382類器官和腫瘤特異性標志物的相關性略小。
接下來，他們研究了HGSC類器官是否代表原始患者樣本在細胞亞群水平。為此，研究者使用CNV推斷單細胞中基因組拷貝數變異變化，并識別群體中類似改變的細胞的亞簇。研究者分析了每位患者的腫瘤樣本和類器官單細胞譜，并確定了3-5個主要的遺傳亞群。對于患者 EOC677，所有的3個亞簇都包含來自4個分析樣本（原發性和復發性腹水以及腹水來源的類器官）的細胞。
綜上所述，這些數據表明，類器官在單細胞水平上與原始腫瘤樣本高度相似。
原文圖5. HGSC 類器官保留了原始腫瘤的轉錄組學特征
6、HGSC類器官藥物反應與患者臨床結果的相關性取決于培養基
最后，研究者對11種類器官培養物進行了藥物反應分析，以研究類器官藥物反應是否與先前在患者中觀察到的藥物反應相關。為此，研究者將懸浮在基底膜提取物中的類器官片段接種到超低附著的384孔微孔板中，并用適合樣品生長的培養基覆蓋培養物。
研究者將生長培養基和人血漿樣培養基（HPLM）中的類器官暴露于HGSC臨床治療中使用的一組藥物（化療藥物：卡鉑、紫杉醇、卡鉑/紫杉醇組合和吉西他濱；PARP抑制劑：奧拉帕尼、尼拉帕尼和魯卡帕尼）和Wee1抑制劑adavosertib。實驗表明類器官培養物對吉西他濱、PARP 抑制劑和 adavosertib的敏感性在M1/M2和HPLM中相似。
然而，生長培養基和HPLM培養的類器官培養物對一線化療藥物卡鉑、紫杉醇及其組合的反應通常不同。然后，研究者探討了體外藥物反應是否與臨床相應患者記錄的藥物反應相匹配。例如，患者EOC677對卡鉑/紫杉醇聯合用藥表現出臨床反應，表現為CA125血液水平降低（從1,593 a.u.降至11 a.u.），隨后穩定在正常范圍內（<35 a.u.）。
與生長培養基相比，這與HPLM中的類器官藥物反應更接近。復發時，患者接受劑量密集型紫杉醇治療，誘導瞬時反應，然后對治療產生耐藥性，這與生長培養基和HPLM中的EOC677_rAsc對紫杉醇的部分耐藥性相匹配。隨后用吉西他濱治療誘導CA125更持久的正?；屯耆派鋵W反應，這與兩種培養基中類器官（特別是 EOC677_pAsc和EOC677_rAsc）的敏感性相對應。
綜上所述，這些結果強調了仔細考慮實驗培養基條件的重要性，以便嘗試將基于類器官的功能測定結果與臨床結果相關聯。
原文圖6. HGSC類器官藥物反應與臨床結果的相關性取決于培養基
三、編者點評
本研究提出了一種高效的HGSC類器官衍生和長期培養的方法，并對這些模型進行了全面驗證，證明它們保留了患者特定的遺傳和表型特征。本研究還強調需要進一步評估培養條件，以促進HGSC類器官在癌癥研究中的廣泛應用及其在個性化癌癥醫學中的相關性。
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