轉錄因子（transcription factors, TFs）是指通過結合基因上游特異核苷酸序列，進而調控該基因轉錄的一類蛋白質。轉錄因子可以協調，驅動基因表達，構成了復雜的轉錄因子調控網絡，從而調控免疫反應、發育模式等許多生命進程。因此分析轉錄因子表達及其調控活性對于解析復雜生命活動具有重要意義。
SCENIC（single-cell regulatory network inference and clustering）是一種基于共表達和motif分析的技術，旨在推斷單細胞轉錄組數據中存在的轉錄因子及其靶基因并構建調控網絡，以直觀查看基因表達調控關系和鑒定細胞狀態。以Python語言實現的SCENIC（pySCENIC）速度較快。在輸入單細胞基因表達量矩陣后，pySCENIC的分析過程分為三步：1. 基于共表達模式 (coexpression pattern) 推斷轉錄因子及其所有的候選靶基因 (target genes)；2. cisTarget分析每個共表達模塊中的基因，去除間接靶標基因，僅保留TF motif富集的模塊和targets，被保留的TF-target genes 稱為regulon；3. AUCelll為每個細胞的regulon活性打分，構建細胞-regulon 活性矩陣。
案例分析
研究概況
樣本信息
實驗組：8個膀胱癌樣本對照組：3個癌旁粘膜樣本
研究過程及結果
（著重解讀pySCENIC分析）
（著重解讀pySCENIC分析）
作者進行單細胞測序后進行了分群，把52721個細胞分成了8個主群，分別是上皮細胞（EPCAM+）；內皮細胞（CD31+）；兩種類型的成纖維細胞（COL1A1+）---炎癥性癌癥相關成纖維細胞iCAFs（PDGFRA+）和肌癌癥相關成纖維細胞mCAFs（RGS5+）；B細胞（CD79A+）；骨髓細胞 (LYZ+）；T細胞（CD3D+）和肥大細胞（TPSAB1+）（圖1）。
圖1.按細胞類型著色的tSNE圖
被招募到腫瘤區域的單核細胞經歷M2極化
髓系細胞進一步分為了7個亞群：腫瘤相關巨噬細胞TAMs（MRC1+C1high）；CD1C+樹突狀細胞（CD1C+DCs，CD1C+CLEC10A+）；單核細胞（S100A8+S100A9+）；增殖的骨髓細胞 (TOP2A+); 交叉呈現的DCs (CLEC9A+); 濾泡B細胞 (CD79A+MS4A1+）；和LAMP3+ DCs（LAMP3+CCR7+）（圖2a）。并且用流式細胞儀證實了這些亞群。不同細胞類型之間的差異也可以通過TF motif的活性來確定 (圖2b)。
圖2
a. LYZ+細胞亞群的tSNE圖
b. SCENIC分析得到的TF motif的活性也可以識別細胞亞群。以每一行的Z-score顯示
b. SCENIC分析得到的TF motif的活性也可以識別細胞亞群。以每一行的Z-score顯示
值得注意的是，單核細胞主要來源于正常粘膜組織，而腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）在膀胱癌組織中富集。此外，這兩種細胞的轉錄組似乎呈現出持續的變化，表明招募到腫瘤區域的單核細胞被重編程為TAMs (圖3a)。為了進一步研究這個持續的過程，作者對單核細胞和TAMs進行了擬時序分析和RNA速率分析，也觀察到了類似的現象（圖3b）。結合SCENIC分析識別到的關鍵motif，作者發現單核細胞被重編程為TAMs的過程中，三個motif (BACH1、MAFG和NFE2) 的活性下調，與此同時MAF、STAT1和STAT2的motif活性升高，這可能是導致M2極化的原因（圖3c）。這些結果為抑制或者逆轉免疫抑制微環境的形成提供了潛在靶點。
圖3
a. 單核細胞與TAMs之間差異表達的基因，紅色框顯示兩組細胞的共同特征。b. Monocle2預測的從單核細胞到TAMs的分化軌跡
c. 在分化過程中被明顯抑制或激活的TF motif，以細胞群著色
在膀胱癌中鑒定到兩種不同的成纖維細胞亞型
成纖維細胞進一步被分為兩種不同的類型（圖4a）：PDGFRA+成纖維細胞（iCAFs）表現出多種細胞因子和趨化因子的強烈表達，RGS5+成纖維細胞具有與肌癌相關成纖維細胞(mCAFs)相似的特征。通過GO富集分析，作者探究了這兩種細胞類型的功能富集通路。接著SCENIC分析進一步研究了這兩種成纖維細胞類型的功能。發現MEF2D和MEF2C是mCAF的特異性motif，這些motif在肌肉系的轉錄調控中具有深遠的作用。Motif TCF21和TWIST2在iCAFs中被高度激活，TCF21與冠心病有關，能夠增強平滑肌細胞的“纖維肌細胞”表型 (圖4b, c)。
a. 成纖維細胞的tSNE圖，按集群（上方）和亞群標記（下方）著色
b. 由SCENIC估計的每個細胞的TF motif的曲線下面積（AUC）得分的熱圖。顯示的分別是iCAFs和mCAFs中前五個激活的motif
c. tSNE圖按轉錄因子表達水平（上方）和AUC分數著色（下方）著色
結 語
通過以上案例，我們可以發現pySCENIC分析可以幫助驗證細胞類型鑒定的結果，也可以結合擬時序軌跡分析，RNA速率分析等展示分化過程中的motif活性變化，還可以進一步探究細胞功能。希望這次關于pySCENIC進行轉錄因子調控網絡分析的分享可以為老師們提供一些啟發。
【參考文獻】
1.Van de Sande, B., Flerin, C., Davie, K., De Waegeneer, M., Hulselmans, G., Aibar, S., Seurinck, R., Saelens, W., Cannoodt, R., Rouchon, Q., Verbeiren, T., De Maeyer, D., Reumers, J., Saeys, Y., & Aerts, S. (2020). A scalable SCENIC workflow for single-cell gene regulatory network analysis. Nature protocols, 15(7), 2247–2276.
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