翌圣UDG酶：PCR反應中的“防污專家”
操作環境中的氣溶膠污染是造成PCR結果假陽性最常見的因素。美國科學家Lindahl最早在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中發現了UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶），UDG酶與dUTP搭配使用，可建立PCR防污染體系，保證PCR擴增結果的準確性。
UDG酶可有效催化水解單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵，但對RNA無活性。使用UDG酶時，以dUTP取代dTTP進行PCR擴增，在PCR反應開始前，UDG酶能降解含尿嘧啶的PCR產物，消除PCR殘余污染。
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UDG酶作用原理
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dUTP/UDG酶是作為PCR反應體系的配制成分發揮防污染作用的。PCR反應前，在25℃、10 min的條件下，UDG酶催化水解含有dU-DNA鏈中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵，產生缺嘧啶位點，釋放游離尿嘧啶。然后進行95℃、10 min熱處理，使UDG酶失活。同時，高溫使得缺嘧啶位點的磷酸骨架極易水解斷裂，從而消除含有尿嘧啶的PCR產物的污染。天然的、未經修飾的DNA不含dU，不受UDG酶影響，可繼續作為PCR/qPCR擴增的模板進行擴增。
圖1. dUTP/UDG酶防污染系統去除殘留擴增污染物示意圖
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翌圣生物-Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG)
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1. 產品特性
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Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG) , 1 U/μL（Cat#10303ES）來源于嗜冷海洋細菌，是經大腸桿菌表達純化的重組蛋白，在25-37℃發揮活性， 可輕松控制氣溶膠污染，適用于PCR、qPCR、RT-qPCR及RT-LAMP等常見分子生物學體系。
1）10 U本品經E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測，E.coli基因組殘留低于10拷貝。
2）無核酸內外切酶和RNase殘留。
3）尿嘧啶是此酶識別的唯一堿基。
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2. 使用方法（僅供參考）
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1）根據實驗需要，dUTP終濃度可在0.2~0.6 mM之間調整，并選擇性摻入0.2 mM dTTP。
2）反應體系中UDG酶的添加量為1個單位，30 min內可消化1 μg dU-DNA。
3）PCR反應程序前加上25℃~37℃，2~10 min的保溫步驟活化UDG酶活性。
4）根據實驗需求，正常進行后續PCR程序。
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3. 消化能力強：0.025 U防污染UDG酶即可完全消化360 ng 200 bp的dU-DNA。
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圖2. 0.05 U、0.025 U、0.0125 U、0.00625 U、0.003125 U防污染 UDG酶與360 ng 200 bp dU-DNA在25℃孵育30 min電泳結果圖。
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4. 兼容性強：完美兼容下游qPCR以及RT-qPCR反應體系，在高投入量下對檢測體系無影響。
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圖3. 不同濃度防污染UDG酶可兼容qPCR以及RT-qPCR反應體系，對DNA及RNA模板擴增無抑制。
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5. 應用場景
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1）去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基，對RNA無活性。
2）去除PCR殘留污染，消除由于PCR擴增產物的污染導致的假陽性結果。
3）適用于PCR、qPCR、RT-qPCR等反應。
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FAQ
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Q1: UDG酶可以用于已存在的擴增產物氣溶膠污染嗎？
A: 已存在的擴增產物氣溶膠污染不含dU，此時UDG酶不能發揮作用。建議選取其他擴增區域，重新設計引物，并建立dUTP/UDG酶防污染系統，即可避免“未來”的氣溶膠污染。
Q2: dUTP會影響擴增產物的dU-DNA在雜交、測序、克隆和酶切等方面的下游應用嗎？
A：含dU的PCR產物可正常進行核酸雜交和測序，效果與常規PCR產物無差別。在分子克隆實驗中，連接產物需使用UDG酶缺失的感受態細胞進行轉化和質粒擴增。酶切實驗中，已證實EcoRI和BamHI不受dU影響，但HindIII酶切效率有所降低，更多內切酶效果還需自行嘗試。
Q3: 含dU的PCR產物后續做了連接和轉化，無克隆，這是什么原因？
A: 需要特別注意在分子克隆實驗中，連接產物需使用UDG酶缺失的感受態細胞進行轉化和后續的質粒擴增。
Q4: UDG酶會切割RNA嗎？
A: 不會。在生物體內，UDG酶在DNA修復過程中發揮重要作用。它可以修復dC脫氨基形成dU的突變，進而避免GC堿基對突變為AT堿基對的可能。
Q5: UDG酶反應Buffer是什么？
A: UDG酶可以在各類緩沖液中發揮作用，如常規的Taq酶Buffer、連接酶Buffer、酶切Buffer等。
Q6: UDG酶對DNA鏈的堿基個數有要求嗎？
A: 不能從6堿基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。
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