RNA與蛋白質(zhì)的相互作用是細(xì)胞生理過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)的決定性因素之一。近年來(lái)，隨著技術(shù)的改進(jìn)和新方法的建立，RNA和蛋白質(zhì)的相互作用研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。目前科研人員已經(jīng)鑒定了較多RNA上的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，也發(fā)現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)中的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并對(duì)它們的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究。這些為最終探明RNA和蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制，從而從本質(zhì)上認(rèn)識(shí)相關(guān)的細(xì)胞生理過(guò)程打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
RNA pull-down作為研究RNA與蛋白互作的核心技術(shù)，已成為研究焦點(diǎn)。RNA pull down是使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用，或者結(jié)合MS篩選RNA結(jié)合的未知蛋白。
RNA pull-down作為研究RNA與蛋白互作的核心技術(shù)，已成為研究焦點(diǎn)。RNA pull down是使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用，或者結(jié)合MS篩選RNA結(jié)合的未知蛋白。
RNA pull down技術(shù)應(yīng)用
癌癥腫瘤相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究
LncRNA發(fā)揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯、發(fā)揮ceRNA、增強(qiáng)子RNA作用等，從而對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發(fā)揮調(diào)控作用。
lncRNA能夠通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝、谷氨酰胺代謝和脂類代謝途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)節(jié)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取增加、谷氨酰胺分解增強(qiáng)及脂質(zhì)生成增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，大多數(shù)lncRNA在腫瘤細(xì)胞能量代謝中的功能和調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和了解腫瘤細(xì)胞中與lncRNA相關(guān)的能量代謝異常表現(xiàn)出的惡性生物學(xué)行為，將有助于為腫瘤的診斷和治療提供有效的證據(jù)及新的思路和途徑。
環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近來(lái)研究很熱門的一種特殊的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平具有調(diào)控基因表達(dá)的重要功能，并且參與多種腫瘤和其他疾病的病理發(fā)展過(guò)程
circRNA大多由外顯子序列組成，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定，高度保守性，通過(guò)微小RNA“海綿”作用調(diào)控靶基因表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。這些特性使circRNA有潛力成為腫瘤新型分子診斷標(biāo)志物。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與腫瘤相關(guān)微小RNA的結(jié)合，可以開(kāi)發(fā)針對(duì)circRNA分子靶點(diǎn)的靶向治療藥。因此,circRNA在腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中意義巨大。
多種人類疾病研究
RBPs在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控mRNA穩(wěn)定性、LncRNA活性、應(yīng)激、腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋亡等眾多生物學(xué)過(guò)程，且與諸多人類疾病密切相關(guān)。因此，對(duì)RBPs-RNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究和鑒定有重要意義。但由于RBPs作用方式復(fù)雜、功能多樣性、作用空間位置多樣化等原因，對(duì)其開(kāi)展精確研究一直是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。RNA領(lǐng)域，尤其是非編碼RNA研究的快速發(fā)展，催生了多種RBPs-RNAs相互作用鑒定技術(shù)。
RNA pull- down實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題
案例展示
案例一
題目：The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation
小結(jié)：RNA pull-down設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及反義鏈對(duì)照組，銀染找出差異條帶進(jìn)行膠條質(zhì)譜鑒定，分析結(jié)果篩選得到STAT3蛋白，進(jìn)一步通過(guò)RIP-qPCR反向驗(yàn)證，證實(shí)STAT3蛋白可以與lnc-DC結(jié)合。
案例二
題目：The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL
小結(jié)：先用Linc1992全長(zhǎng)進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，通過(guò)WB檢測(cè)手段分析四個(gè)意向蛋白中篩選得到一個(gè)差異蛋白α-hnRNPL，通過(guò)分段RNA pull-down及WB分析核心結(jié)合區(qū)域，主要是Linc1992的1-699和1406-2012區(qū)域，通過(guò)RIP-qPCR反向驗(yàn)證，證明α-hnRNPL蛋白可以與Linc1992結(jié)合。
