Millipore引領蛋白質研究領域的創新潮

自從1979年，Towbin發明Western blotting以來，Western blotting已經成為實驗室研究的一種常規工具，它一般用于檢測復雜樣品中的少量蛋白質或監測蛋白質的表達和純化。Western blotting的過程包括用凝膠電泳分離蛋白質混合物，隨后電轉移到適當的膜上，再通過與標記抗體或抗原的反應，最后鑒定特定的蛋白質。

雖然Western blotting技術已經非常成熟，但人們對此項技術仍進行著不斷的改進。在蛋白質樣品制備方面，從簡單的細胞裂解到使用超濾裝置（如Millipore的Microcon和Amicon）對蛋白樣品進行濃縮和純化，極大地提高了樣品的質量，使得Western blotting檢測的范圍更加擴大。蛋白質轉移膜也從最初的硝酸纖維素膜進化到具有更強吸附力的PVDF膜，進而發展到今天的具有各種特殊用途的專業PVDF膜（如Millipore專為分析小分子蛋白設計的Immobilon-P^SQ和專為熒光顯色設計的Immobilon-FL等）。在抗體雜交方法上，除了傳統的抗體雜交方法外，隨著Millipore第一張PVDF膜的誕生，快速抗體雜交法也隨之誕生了，此種方法省去了封閉處理，加快了抗體雜交的速度。但Millipore的科學家們并不就此滿足，2008年Millipore又推出了SNAP i.d.抗體雜交加速器，它徹底改變了抗體雜交的原理，將抗體雜交的時間從4到20個小時減少為30分鐘。此外，在Western的檢測手段上技術也不斷提高，高靈敏度的化學顯色底物已經代替了低靈敏度的化學顯色底物，其靈敏度已經達到了飛克級（如Millipore的Immobilon^TM Western HRP底物）。

這一切都使得今天的Western blotting變得更快，更好，更簡單，下面將給大家介紹一些最近的新產品。

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1.??????? 半小時完成抗體雜交！―SNAP i.d. 抗體雜交加速器

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圖1：SNAP i.d.抗體雜交加速器

SNAP i.d.抗體雜交加速器由主體，托盤，和抗體收集盤三部分組成。托盤又分為單個托盤，雙聯托盤和三聯托盤，可同時進行1到3片膜的操作。主體可以容納兩個托盤，所以每個SNAP i.d.最多可以同時檢測6張膜。

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傳統的Western blotting抗體雜交法是依靠被動地分子擴散來達到封閉膜，一抗識別抗原，二抗識別一抗，以及去除非特異性結合等目的。此過程緩慢且受到溶液與膜的接觸程度，溶液體積，孵育時間，孵育溫度，封閉劑溶解程度等諸多因素的影響，導致Western blotting結果重復性不好，而且對于低豐度蛋白的檢出靈敏度不佳。Millipore的SNAP i.d.創新性地使用了真空抽濾的方法，使得封閉劑，抗體溶液和洗脫液主動地通過膜，并與膜上的蛋白發生反應。此種方法具有以下優點（見表1）：

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l??????? 節約時間：通過真空抽濾的方法，使封閉，抗體孵育以及洗脫全過程從傳統的4小時甚至兩天縮短到30分鐘。

l??????? 保證檢測的靈敏度：由于抗原抗體的主動接觸，且抗體溶液均勻穿透整張膜，使得抗體有機會充分地接觸到膜內的蛋白質，提高了抗原抗體結合的成功率，保證檢測靈敏度。

l??????? 降低雜交背景：

n??????? 由于抗體與膜的接觸時間被縮短，極大地降低了抗體與膜的非特異性結合。

n??????? 通過真空抽濾的方法使得洗脫過程更為徹底，克服了傳統洗脫方法的低效率。

n??????? 封閉劑與膜主動全方位的接觸，封閉時間由一個小時降低到20秒，提高了封閉的效率，同時封閉劑濃度由5%的脫脂牛奶降低到0.5%的脫脂牛奶，大大地降低了脫脂牛奶因不能完全溶解而造成的高背景，以及可能發生的過度封閉等問題。

l??????? 延長抗體壽命：對于抗體而言，SNAP i.d.極大地降低了抗體暴露在室溫中的時間，延長了抗體的壽命，增加了抗體重復使用的機會。

l??????? 高兼容性：既可以與上游各種蛋白轉移膜包括各種PVDF膜和NC膜兼容，也可以和下游各種化學或熒光檢測方法兼容。

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表1：SNAP i.d.與傳統抗體雜交法的比較

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基于SNAP i.d.抗體雜交加速器的以上優點，該技術為各種表達豐度和各種分子量大小的蛋白質檢測提供了一個快速，靈敏，方便，可靠的解決方案。SNAP i.d.還適用于快速優化抗體的濃度，大大減少了摸索實驗條件所花費的時間，提高了工作的效率和實驗的成功率，是優化抗體濃度的最佳選擇。

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2.極低熒光背景的PVDF膜―Immobilon^TM-FL

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蛋白轉印膜是Western blotting的核心。作為轉印膜技術的鼻祖，Millipore一直引領著實驗室轉印膜技術的發展。繼1975年E. M. Southern用Millipore的硝酸纖維素膜發明Southern blotting技術后，1979年H. Towbin用Millipore的硝酸纖維素膜進行了世界上第一次Western blotting實驗，從此開創了Western blotting技術。1985年Millipore為了進一步提高Western blotting技術，發明了0.45μm 的PVDF膜Immobilon^TM-P，它打破了硝酸纖維素（NC）膜一統天下的局面。PVDF膜以其優良的機械性能，超強的吸附能力，逐漸取代了NC膜，成為Western blotting的首選（詳見表2）。

1988年Millipore發明了專用于檢測小分子蛋白質的0.2μm PVDF膜Immobilon^TM-P^SQ。 Immobilon^TM-PSQ以其緊密的孔隙結構和高內表面積，能夠吸附100%的蛋白質，特別是對小于20KDa的蛋白質具有超強的結合力，適用于全部蛋白分析，小分子蛋白質的免疫檢測，氨基酸分析，和N-端蛋白質測序等。另外，Immobilon^TM-P^SQ轉印膜不含污染性支撐物或表面活性劑，故在層析譜上的背景峰值極小，適用于直接從膜上回收蛋白質進行質譜分析。

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表2：PVDF膜與醋酸纖維素膜(NC)膜的比較

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Millipore最新推出的Immobilon^TM-FL是第一個專門為熒光顯色設計的轉移膜。它除具有PVDF膜的所有優點外，其熒光背景還比一般的PVDF膜低10倍，比NC膜低2倍，進而提高了熒光檢測的靈敏度（見圖2）。此外，Immobilon^TM-FL與所有常用的熒光探針（所有激發和發射波長）都兼容，具有普遍的適用性，是多態性檢測和各種熒光檢測的最佳選擇。

圖2：與其他轉印膜相比，Immobilon^TM-FL具有極低的熒光背景。

3.可檢測飛克級蛋白的底物―Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物

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化學發光檢測中的酶催化反應可產生可見光，如辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。這種方法具有檢測速度快，安全，靈敏等特點。傳統低靈敏度的底物僅限于皮克級（10^-12 g）的蛋白檢測，這些底物無法檢測到低豐度表達的蛋白。

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Millipore最新推出的高靈敏度底物―Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物，能夠檢測飛克級（10^-15 g）的蛋白質，是檢測低豐度蛋白質必不可少的工具。對于中等或高豐度蛋白，該底物所使用的一抗和二抗的量比使用傳統檢測底物所需的量低20倍，極大地節約了抗體的使用，降低了實驗的成本（如圖3）。而且，由于抗體濃度的降低，也有助于減少非特異的雜交背景，使Western的結果更加清晰，信噪比更高（如圖3）。