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Millipore引領(lǐng)蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的創(chuàng)新潮

自從1979年，Towbin發(fā)明Western blotting以來，Western blotting已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室研究的一種常規(guī)工具，它一般用于檢測復(fù)雜樣品中的少量蛋白質(zhì)或監(jiān)測蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。Western blotting的過程包括用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)混合物，隨后電轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪ど希偻ㄟ^與標(biāo)記抗體或抗原的反應(yīng)，最后鑒定特定的蛋白質(zhì)。

雖然Western blotting技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但人們對(duì)此項(xiàng)技術(shù)仍進(jìn)行著不斷的改進(jìn)。在蛋白質(zhì)樣品制備方面，從簡單的細(xì)胞裂解到使用超濾裝置（如Millipore的Microcon和Amicon）對(duì)蛋白樣品進(jìn)行濃縮和純化，極大地提高了樣品的質(zhì)量，使得Western blotting檢測的范圍更加擴(kuò)大。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜也從最初的硝酸纖維素膜進(jìn)化到具有更強(qiáng)吸附力的PVDF膜，進(jìn)而發(fā)展到今天的具有各種特殊用途的專業(yè)PVDF膜（如Millipore專為分析小分子蛋白設(shè)計(jì)的Immobilon-P^SQ和專為熒光顯色設(shè)計(jì)的Immobilon-FL等）。在抗體雜交方法上，除了傳統(tǒng)的抗體雜交方法外，隨著Millipore第一張PVDF膜的誕生，快速抗體雜交法也隨之誕生了，此種方法省去了封閉處理，加快了抗體雜交的速度。但Millipore的科學(xué)家們并不就此滿足，2008年Millipore又推出了SNAP i.d.抗體雜交加速器，它徹底改變了抗體雜交的原理，將抗體雜交的時(shí)間從4到20個(gè)小時(shí)減少為30分鐘。此外，在Western的檢測手段上技術(shù)也不斷提高，高靈敏度的化學(xué)顯色底物已經(jīng)代替了低靈敏度的化學(xué)顯色底物，其靈敏度已經(jīng)達(dá)到了飛克級(jí)（如Millipore的Immobilon^TM Western HRP底物）。

這一切都使得今天的Western blotting變得更快，更好，更簡單，下面將給大家介紹一些最近的新產(chǎn)品。

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1.??????? 半小時(shí)完成抗體雜交！―SNAP i.d. 抗體雜交加速器

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圖1：SNAP i.d.抗體雜交加速器

SNAP i.d.抗體雜交加速器由主體，托盤，和抗體收集盤三部分組成。托盤又分為單個(gè)托盤，雙聯(lián)托盤和三聯(lián)托盤，可同時(shí)進(jìn)行1到3片膜的操作。主體可以容納兩個(gè)托盤，所以每個(gè)SNAP i.d.最多可以同時(shí)檢測6張膜。

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傳統(tǒng)的Western blotting抗體雜交法是依靠被動(dòng)地分子擴(kuò)散來達(dá)到封閉膜，一抗識(shí)別抗原，二抗識(shí)別一抗，以及去除非特異性結(jié)合等目的。此過程緩慢且受到溶液與膜的接觸程度，溶液體積，孵育時(shí)間，孵育溫度，封閉劑溶解程度等諸多因素的影響，導(dǎo)致Western blotting結(jié)果重復(fù)性不好，而且對(duì)于低豐度蛋白的檢出靈敏度不佳。Millipore的SNAP i.d.創(chuàng)新性地使用了真空抽濾的方法，使得封閉劑，抗體溶液和洗脫液主動(dòng)地通過膜，并與膜上的蛋白發(fā)生反應(yīng)。此種方法具有以下優(yōu)點(diǎn)（見表1）：

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l??????? 節(jié)約時(shí)間：通過真空抽濾的方法，使封閉，抗體孵育以及洗脫全過程從傳統(tǒng)的4小時(shí)甚至兩天縮短到30分鐘。

l??????? 保證檢測的靈敏度：由于抗原抗體的主動(dòng)接觸，且抗體溶液均勻穿透整張膜，使得抗體有機(jī)會(huì)充分地接觸到膜內(nèi)的蛋白質(zhì)，提高了抗原抗體結(jié)合的成功率，保證檢測靈敏度。

l??????? 降低雜交背景：

n??????? 由于抗體與膜的接觸時(shí)間被縮短，極大地降低了抗體與膜的非特異性結(jié)合。

n??????? 通過真空抽濾的方法使得洗脫過程更為徹底，克服了傳統(tǒng)洗脫方法的低效率。

n??????? 封閉劑與膜主動(dòng)全方位的接觸，封閉時(shí)間由一個(gè)小時(shí)降低到20秒，提高了封閉的效率，同時(shí)封閉劑濃度由5%的脫脂牛奶降低到0.5%的脫脂牛奶，大大地降低了脫脂牛奶因不能完全溶解而造成的高背景，以及可能發(fā)生的過度封閉等問題。

l??????? 延長抗體壽命：對(duì)于抗體而言，SNAP i.d.極大地降低了抗體暴露在室溫中的時(shí)間，延長了抗體的壽命，增加了抗體重復(fù)使用的機(jī)會(huì)。

l??????? 高兼容性：既可以與上游各種蛋白轉(zhuǎn)移膜包括各種PVDF膜和NC膜兼容，也可以和下游各種化學(xué)或熒光檢測方法兼容。

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表1：SNAP i.d.與傳統(tǒng)抗體雜交法的比較

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基于SNAP i.d.抗體雜交加速器的以上優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)為各種表達(dá)豐度和各種分子量大小的蛋白質(zhì)檢測提供了一個(gè)快速，靈敏，方便，可靠的解決方案。SNAP i.d.還適用于快速優(yōu)化抗體的濃度，大大減少了摸索實(shí)驗(yàn)條件所花費(fèi)的時(shí)間，提高了工作的效率和實(shí)驗(yàn)的成功率，是優(yōu)化抗體濃度的最佳選擇。

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2.極低熒光背景的PVDF膜―Immobilon^TM-FL

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蛋白轉(zhuǎn)印膜是Western blotting的核心。作為轉(zhuǎn)印膜技術(shù)的鼻祖，Millipore一直引領(lǐng)著實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)印膜技術(shù)的發(fā)展。繼1975年E. M. Southern用Millipore的硝酸纖維素膜發(fā)明Southern blotting技術(shù)后，1979年H. Towbin用Millipore的硝酸纖維素膜進(jìn)行了世界上第一次Western blotting實(shí)驗(yàn)，從此開創(chuàng)了Western blotting技術(shù)。1985年Millipore為了進(jìn)一步提高Western blotting技術(shù)，發(fā)明了0.45μm 的PVDF膜Immobilon^TM-P，它打破了硝酸纖維素（NC）膜一統(tǒng)天下的局面。PVDF膜以其優(yōu)良的機(jī)械性能，超強(qiáng)的吸附能力，逐漸取代了NC膜，成為Western blotting的首選（詳見表2）。

1988年Millipore發(fā)明了專用于檢測小分子蛋白質(zhì)的0.2μm PVDF膜Immobilon^TM-P^SQ。 Immobilon^TM-PSQ以其緊密的孔隙結(jié)構(gòu)和高內(nèi)表面積，能夠吸附100%的蛋白質(zhì)，特別是對(duì)小于20KDa的蛋白質(zhì)具有超強(qiáng)的結(jié)合力，適用于全部蛋白分析，小分子蛋白質(zhì)的免疫檢測，氨基酸分析，和N-端蛋白質(zhì)測序等。另外，Immobilon^TM-P^SQ轉(zhuǎn)印膜不含污染性支撐物或表面活性劑，故在層析譜上的背景峰值極小，適用于直接從膜上回收蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

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表2：PVDF膜與醋酸纖維素膜(NC)膜的比較

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Millipore最新推出的Immobilon^TM-FL是第一個(gè)專門為熒光顯色設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)移膜。它除具有PVDF膜的所有優(yōu)點(diǎn)外，其熒光背景還比一般的PVDF膜低10倍，比NC膜低2倍，進(jìn)而提高了熒光檢測的靈敏度（見圖2）。此外，Immobilon^TM-FL與所有常用的熒光探針（所有激發(fā)和發(fā)射波長）都兼容，具有普遍的適用性，是多態(tài)性檢測和各種熒光檢測的最佳選擇。

圖2：與其他轉(zhuǎn)印膜相比，Immobilon^TM-FL具有極低的熒光背景。

3.可檢測飛克級(jí)蛋白的底物―Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物

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化學(xué)發(fā)光檢測中的酶催化反應(yīng)可產(chǎn)生可見光，如辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。這種方法具有檢測速度快，安全，靈敏等特點(diǎn)。傳統(tǒng)低靈敏度的底物僅限于皮克級(jí)（10^-12 g）的蛋白檢測，這些底物無法檢測到低豐度表達(dá)的蛋白。

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Millipore最新推出的高靈敏度底物―Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物，能夠檢測飛克級(jí)（10^-15 g）的蛋白質(zhì)，是檢測低豐度蛋白質(zhì)必不可少的工具。對(duì)于中等或高豐度蛋白，該底物所使用的一抗和二抗的量比使用傳統(tǒng)檢測底物所需的量低20倍，極大地節(jié)約了抗體的使用，降低了實(shí)驗(yàn)的成本（如圖3）。而且，由于抗體濃度的降低，也有助于減少非特異的雜交背景，使Western的結(jié)果更加清晰，信噪比更高（如圖3）。