近年來，使用腺相關病毒（AAV）載體進行體內基因轉移的臨床試驗數量穩步增加。出色的安全性，以及廣泛靶組織的高效轉導，使AAV載體成為體內基因治療的首選平臺。即便安全性高，但也不代表AAV沒有任何的毒性作用，尤其是肝臟毒性。
肝臟是人體重要的代謝器官，而AAV具有較為強烈的噬肝性，尤其是高劑量的AAV會導致大量的病毒顆粒在肝臟聚集及表達，這可能會導致臨床問題，以及動物實驗數據不準確，那么如何解決這個問題呢？
脊髓性肌萎縮癥（SMA）是一種常染色體隱性、兒童期發病的運動神經元疾病。SMA的起因是SMN1突變或缺失，這種蛋白質的缺乏與運動神經元死亡直接相關，導致肌肉控制、力量和功能的逐漸喪失，從而導致吞咽和呼吸困難，最終個體死亡。Onasemnogene abeparvovec（OA）是單劑量靜脈內基因療法，通過AAV9遞送SMN1解決SMA的單基因疾病。然而，它會引起免疫反應，導致肝臟產生的酶增加。
基因治療先驅James M. Wilson指出高劑量的AAV有潛在毒性1，一名患有肝酶缺乏癥的患者，18歲的Jesse Gelsinger在接受基因治療四天后死亡。Gelsinger在試驗中接受了最高劑量，3.8x1015個病毒顆粒。高劑量的AAV載體導致對宿主的兩種獨立影響：對肝細胞的直接損傷，以及全身炎癥和相關的凝血病的激活。
miR-122是肝臟特異性表達的miRNA，肖2等人將其5個拷貝的靶序列miR-122T插入許多AAV載體的3′非翻譯區（UTR）中，可以有效降低靜脈注射AAV對肝臟的損傷：
將AAV9-CB-Luc-5xmiR-122T載體和不含miR-122T的對照AAV9-CB-Luc通過尾靜脈注射以1×1012的劑量遞送到6周齡的小鼠中，三周后處死，分析骨骼肌、心肌和肝臟的熒光素酶活性：
結果顯示，帶有miR-122T的組比對照在肝臟表達降低了50倍。為了進一步評估miR-122T對降低肝臟轉基因表達的影響，作者利用心肌特異性啟動子en-MHC-TNT和報告基因LacZ進行了小鼠實驗，將組織冷凍切片并進行X-gal染色。注射含有 miR-122T的載體的小鼠肝臟中 LacZ 表達量降低了約 70 倍：
雖然AAV對肝臟毒性不全部由基因在肝臟的表達引起的，一部分是肝臟處的免疫細胞識別到病毒進而引發免疫反應，但后者很難優化，而一些應用性的實驗表明，只阻斷外源基因在肝臟的非必要表達能夠大大降低肝臟毒性。
應用案例
案例一
Benjamin3等人開發了一種全新的、靜脈遞送、針對中樞神經系統內皮的外殼——AAV-BI30，在相對較低的全身劑量下，該AAV病毒能夠有效轉導成年C57BL/6小鼠的大腦，視網膜和脊髓脈管系統中的大部分動脈，毛細血管和靜脈內皮細胞。
作者從病毒注射后開始，每24小時稱重小鼠，連續20天，在給藥后一周，低劑量1×1011的AAV呈現出了不良反應，表現為體重減輕、嗜睡行為，在測試的最高劑量1x1012下死亡。尸檢顯示肝細胞轉導強烈，伴有異常的核形態（圖C）。作者隨即插入三個重復的miR-122T，防止了體重的異常變化，維持住了小鼠較優的狀態（圖D）：
且有效地抑制了NLS-GFP轉基因的肝細胞表達，且不影響對中樞神經系統脈管系統的轉導：
案例二
脂肪組織在能量和代謝穩態中起著關鍵作用， 但是，當前技術來調節體內脂肪功能具有挑戰性。作者構建了含有巨細胞病毒啟動子調控報告基因的AAV載體，使用脂聯素啟動子/增強子元件和肝臟特異性mir-122T靶位點，限制了報告基因對脂肪組織的表達（Scr為無義對照序列，Mir為mir-122T）。作為療效證明，將瘦素基因摻入脂肪靶向表達載體中，包裝到AAV2/8中，并靜脈內給藥9至10周齡的小鼠。在8周內測量表型變化。瘦素mRNA和蛋白質在脂肪中表達，瘦素蛋白分泌到血漿中。小鼠的反應是逆轉體重增加，降低高胰島素血癥和改善葡萄糖耐量。
在該系統中，串聯的mir-122T極大減少了病毒在肝臟的表達，且不影響瘦素對于小鼠表型的改變。
總之，AAV并不像人們想象的那么安全，尤其在高劑量使用場景下。通過優化外殼，努力提升AAV對靶細胞的噬性，降低非目的細胞的感染，從而減少劑量是臨床以及動物實驗努力的方向；此外，通過特異性啟動子更大限定AAV在靶細胞的表達也是其優化點之一。在當前基于動物實驗的AAV，若部分實驗注射之后，出現小鼠死亡、體重異常變化、狀態不佳等情況時，可以考慮到肝臟毒性，則可以通過上述方式，在目的基因之后插入mir-122T解除該副作用。吉凱基因長期為客戶提供前沿、新穎的病毒使用策略，有興趣的老師快來咨詢吧?。?！
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【參考文獻】
1.Hepatotoxicity following administration of onasemnogene abeparvovec (AVXS-101) for the treatment of spinal muscular atrophy
2.Liver-specific microRNA-122 target sequences incorporated in AAV vectors efficiently inhibits transgene expression in the liver
3.A High-Efficiency AAV for Endothelial Cell Transduction Throughout the Central Nervous System
4.Targeting adipose tissue via systemic gene therapy