編者按 氣道上皮細胞（AECs）是抵御外源抗原的第一道防線，外源抗原通過分泌生物活性介質來影響肺部的微環境，有助于將樹突狀細胞（DCs）等免疫細胞募集到發炎區域，從而刺激過敏性炎癥。細胞間通訊對哮*發病機理至關重要，并且主要由可溶性介體介導。外泌體是細胞間通訊中的重要角色。然而，氣道上皮細胞（AECs）產生的外泌體是否參與哮*的發展尚不清楚。 2021年4月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院呼吸科研究團隊在Journal of Allergy and Clinical Immunology雜志（IF=10.228）上發表題目為“Epithelial exosomal contactin-1 promotes monocyte-derived dendritic cells-dominant T cell responses in asthma”的研究成果，利用lable-free蛋白質組學技術及分子生物學手段揭示了外泌體蛋白CNTN1介導的哮*發病新機制，該研究為治療過敏性氣道炎癥提供了新的策略。中科新生命提供了外泌體label-free蛋白質組學技術服務。 【研究材料】 屋塵螨（HDM）刺激原代氣道上皮細胞（pAECs）產生的外泌體；對照選用PBS處理的pAECs產生的外泌體 【組學方法】 Label-free蛋白質組學技術 TEM和NTA分析AECs分泌的外泌體特征 分析AECs分泌的外泌體是否參與哮*的免疫應答 探索AECs分泌的外泌體參與DCs促進哮*的發展 驗證CNTN1介導過敏性氣道炎癥并探索CNTN1的依賴性信號通路分子免疫應答 分析AECs分泌的外泌體是否參與哮*的免疫應答 隊列驗證：CNTN1可作為哮*患者的潛在生物標志物免疫應答 作者首先使用透射電子顯微鏡掃描（TEM）和NTA分析確定HDM處理前后，AECs均具有生成外泌體的能力：囊泡直徑范圍為30至150 nm，且CD63和CD81（外泌體相關標記）染色呈陽性。作者進一步比較了HDM暴露與未暴露的小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的外泌體。 結果表明， HDM處理的小鼠的BALF中，外泌體的數量增加，CD63和CD81的表達也明顯高于對照組。上述結果表明，上皮細胞在正常生理狀態下具有產生外泌體的能力，而在HDM刺激后將釋放出更多的外泌體。 圖1 氣道上皮細胞來源的外泌體促進HDM誘導的過敏性哮* 二、AECs分泌的外泌體參與HDM誘導的過敏性哮* 為了確定AECs分泌的外泌體是否參與哮*的免疫應答過程，作者先用磷脂酶抑制劑GW4869來阻斷外泌體合成與釋放，發現抑制外泌體分泌可以顯著緩解哮*癥狀（炎癥反應降低）；之后用HDM-AECs EXO處理小鼠，發現外源HDM-AECs-EXO可以誘導并顯著增強了2/17型免疫反應，導致肺中嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞過多。這說明源自AECs分泌的外泌體參與了HDM 誘發的哮*反應。 三、AEC衍生的外泌體促進DCs的募集，增殖和活化 為了確定AECs來源的外泌體影響的細胞類型，作者在氣管中施用了HDM-AECs-EXO。之后通過流式細胞術（FCM）測定肺細胞譜，發現DCs（樹突狀細胞）的百分比高于其它細胞。之后作者將PKH26標記的HDM-AECs-EXO施用于小鼠的肺部，發現50％的標記外泌體被肺DCs攝取。 作者進一步證實HDM-AECs-EXO處理會激活DCs的功能。這些結果表明，HDM-AECs-EXO暴露可促進DCs的募集，增殖和活化。作者用HDM-AECs-EXO刺激的DCs在敏化期移植到小鼠中，發現EXO-DCs促進過敏性氣道炎癥發生（處理后小鼠BALF細胞增多，嗜酸性細胞，血清炎癥因子升高，支氣管周炎癥加重）。 四、HDM-pAECs-EXO包含CNTN1蛋白 為確定外泌體中影響哮*進程的關鍵成分，作者對PBS處理的pAECs（PBS-pAECs-EXO）和HDM處理的pAEC（HDM-pAECs-EXO）上清中的外泌體進行了Label Free蛋白質組學分析，分別鑒定到486和445個蛋白，27種蛋白在兩組間差異較大。 隨后作者發現在用HDM處理的pAECs或BEAS-2B細胞以及細胞上清外泌體中，CNTN1的表達均增加，免疫組化（IHC）和免疫熒光（IF）檢測觀察到HDM處理的小鼠肺組織中CNTN1同樣增加。這暗示外泌體中的CNTN1可能是介導變應性哮*中促炎作用的效應因子。 五、AECs-EXO中CNTN1蛋白促進過敏性氣道炎癥機制研究 通過腹腔注射CNTN1蛋白，作者發現CNTN1能夠促進DCs在肺內的招募、分化和遷移。之后作者將HDM處理的BMDCs（聯合或不聯合CNTN1）通過鼻內移植WT小鼠。結果發現，HDM與CNTN1聯合引發的BMDCs處理的小鼠肺炎性細胞因子水平升高，支氣管周炎癥增強，粘液產生增加。這些數據證實CNTN1引發的DCs促進哮*的發展。 作者進一步發現在CNTN1暴露后，BMDCs中在mRNA和蛋白水平上Notch2的表達增加，Co-IP證實CNTN1和Notch2存在相互作用。作者使用Notch途徑的阻斷劑GSI，發現GSI可以逆轉CNTN1誘導的過敏性炎癥。這些結果證明CNTN1以Notch2信號傳導依賴性方式誘導DCs活化，從而促進了過敏性氣道炎癥。 六、CNTN1可能作為哮*患者的潛在生物標志物 接下來，作者使用健康對照者，哮*患者（對HDM敏感）和ABPA哮*患者的血液樣本進行了隊列研究。與健康對照組相比，哮*或ABPA患者的血清IgE水平升高，對HDM過敏的哮*患者的無外泌體血清和含外泌體血清中的CNTN1水平顯著增加；數據分析發現哮*患者的血清CNTN1濃度與IgE，呼氣一氧化氮（FeNO）和鼻呼氣一氧化氮（FnNO）呈正相關。這些發現表明CNTN1可作為哮*患者的候選生物標志物。
研究方法
研究結果
一、HDM處理引發AECs分泌外泌體
圖2 上皮細胞衍生的外泌體處理后肺中DCs積累
圖3 HDM引發外泌體中的CNTN1蛋白含量增加
圖4 CNTN1以Notch信號依賴方式誘導DCs激活，進而促進哮*的發展
圖5 哮*患者的CNTN1水平與氣道炎癥反應相關
本研究首次揭示了AECs的外泌體在調節DCs引發的過敏反應中起關鍵作用，發現并證實AECs中的CNTN1蛋白通過Notch2信號通路誘導DCs活化，從而促進了哮*進程。此外，哮*患者的隊列研究表明CNTN1可作為潛在的生物標志物。本研究揭示了外泌體在哮*發病機制中的重要作用，也為過敏性氣道炎癥的臨床治療提供了新的策略。
項目文章：外泌體蛋白質組學解析哮喘進程新機制
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-22T10:15 (訪問量:7402)
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