目前，確定慢性HBV（乙型肝炎病毒）感染的患者何時開始抗病毒治療是一個有爭議的問題。其中一個關鍵原因是區分慢性HBV感染自然進程的生物標志物開發不充分，不能滿足臨床實踐需要。
福建醫科大學附屬第一醫院研究團隊在Materials Today Bio（IF:10.761）上發表了題為“Proteomic characterization of the natural history of chronic HBV infection revealed by tandem mass tag-based quantitative proteomics approach”的文章，揭示了慢性HBV感染自然進展過程中患者血清中的蛋白質變化，以期找到相關的生物標志物。吉凱基因提供了TMT蛋白質組學服務。
考慮到丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、HBV DNA水平和肝臟炎癥出現的情況，慢性HBV感染的自然史（自然進程）可大致分為四個階段：
1. 免疫耐受（IT）或HBeAg陽性慢性感染；
2. 免疫反應性HBeAg陽性（IA）或HBeAg陽性慢性肝炎；
3. 非活躍HBV攜帶狀態（IC）或HBeAg陰性慢性感染；
4. HBeAg陰性慢性肝炎（ENH）。
其中，IA和ENH患者應該進行抗病毒治療，而IT患者則不宜進行抗病毒治療。但部分IT患者表現出和IA類似的特征，這一部分也應進行相應的治療干預，以防止更嚴重的疾病進展。但在當前的臨床實際中，有一些不確定的情況，使得醫生很難判定是否進行相關干預治療。本研究旨在尋找慢性HBV感染不同階段的血液蛋白標志物，為臨床干預治療提供科學依據。
血清蛋白質組學分組策略
收集以上四類疾病階段的病人血清樣本，每10人的樣本混合為1個樣本。收集齊樣本后（IT：2；IA：4；IC：2；ENH：2）先進行去高豐度蛋白，隨后進行TMT蛋白質組學檢測。
研究結果
1. 慢性HBV感染自然進程中的差異蛋白
血清TMT蛋白質組學（去除高豐度蛋白）共檢測到了1162個蛋白。沿著慢性HBV感染進程，共篩選得到116個差異蛋白（DEP）。GO富集分析顯示，這些DEP富集在免疫學過程包括白細胞介導的免疫、免疫響應和免疫效應過程。Reactome pathway分析顯示，DEP主要映射到固有免疫系統和免疫系統。這些結果表明，慢性HBV感染不同階段的蛋白表達變化主要聚焦在免疫病理過程。對226個DEP進行STEM趨勢分析，共顯示有20個表達趨勢簇。其中，只有3個趨勢簇具有統計學顯著性，包括簇15：反映ALT（丙氨酸氨基轉移酶）的表達；簇17：IT階段最低表達以及簇18：ENH階段最高表達。
2. 慢性肝炎和慢性HBV感染間的差異蛋白分析
研究者分析了慢性肝炎（IA+ENH）與慢性感染（IT+IC）之間的差異蛋白。熱圖顯示了這兩種狀態下血清蛋白質特征的特異性?；鹕綀D展示了兩組間的136個差異蛋白，包括130個上調蛋白和6個下調蛋白。和預期一致，很多酶在慢性肝炎組中高表達，包括ALT（丙氨酸氨基轉移酶）和AST（天冬氨酸氨基轉移酶）。Wiki Pathway分析顯示，136個蛋白主要聚集在蛋白酶體降解、糖酵解/糖異生和氨基酸代謝途徑。GSEA分析的結果和上述結果高度一致。尤其是，聚類分析顯示屬于蛋白酶體途徑的兩個蛋白酶體激活亞基1（PSME1）和蛋白酶體亞基α7（PSMA7）顯示了最高表達。因此，研究者用ELISA檢測了血清中的PSME1和PSMA7，結果和蛋白組學的結果一致，相比于慢性感染組，PSME1和PSMA7在慢性肝炎中高表達?？傮w，這些結果表明蛋白酶體通路是最顯著上調的通路，而PSME1和PSMA7在慢性肝炎中高表達。
3.IA（免疫反應性HBeAg陽性）和IT（免疫耐受）之間的差異蛋白分析
IA（免疫反應性HBeAg陽性）和IT（免疫耐受）的患者有高水平的HBV DNA，但是ALT水平則波動較大。為了進一步研究蛋白變化，研究者比較了IA組和IT組的蛋白表達法?；鹕綀D展示了兩組間的119個差異蛋白，包括105個上調蛋白和14個下調蛋白。特別地，CD163是上調最顯著的蛋白。CD163在IA組中的高表達也得到了ELISA實驗的驗證?？傮w上，慢性HBV感染的患者血清與健康人相比有更高的CD163水平。KEGG和GSEA分析表明，蛋白酶體途徑是最顯著上調的通路。研究者用ELISA檢測了血清中蛋白酶體途徑相關蛋白，與蛋白質組學結果一致，與IT患者相比，IA患者表達高水平的PSME1、PSMA7、PSMA6和PSMB10。慢性HBV感染的不同階段比健康人高表達PSMA6。總體，這些結果表明，相比于IT階段的患者，IA階段的患者高表達CD163和多種蛋白酶體相關蛋白。
4. IT（免疫耐受）和非活躍HBV攜帶狀態（IC）之間的差異蛋白分析
IT和IC階段沒有或只有很小程度的炎癥壞死或纖維化，但它們具有不同的病毒載量?；鹕綀D展示了IT組和IC之間的50個差異蛋白。這50個差異蛋白的KEGG分析顯示主要富集在糖酵解/糖異生途徑。特別地，聚類圖顯示EEF2（elongation factor 2）是最顯著上調的蛋白，而MOYC和EFNB2是最顯著下調的蛋白。由于缺少EEF2的ELISA試劑盒，作者檢測了熱反應蛋白12（HRSP12）的水平，該蛋白在IT階段也顯著增加。在慢性HBV感染的不同階段，皮爾森相關性分析顯示EFNB2水平與HBeAg、HBV DNA和HBsAg水平呈負相關。HRSP12與HBeAg、HBV DNA和HBsAg呈正相關。
5. ENH（HBeAg陰性，慢性感染）和IC（非活躍HBV攜帶狀態）之間的差異蛋白分析
ENH和IC階段的特征是HBeAg陰性。研究者進一步比較了ENH和IC之間的蛋白質差異?；鹕綀D展示了兩組間的55個差異蛋白，包括43個上調蛋白和12個下調蛋白。特別地，聚類圖顯示SOD2是最顯著上調的蛋白。GSEA分析顯示，ENH組只有糖酵解/糖異生途徑是上調的。Wiki Pathway和KEGG分析顯示，這55個蛋白主要富集在糖酵解/糖異生途徑，包括FBP1和ENO1。STEM分析得到的簇18含有12種蛋白質，包括白細胞介素18結合蛋白（IL-18BP），其在慢性HBV感染的不同階段顯示出最顯著的不同。接下來，研究者使用ELISA做了進一步驗證。與IC患者相比，ENH患者表達高水平的SOD2、IL-18BP和ENO1。盡管FBP1在ENH患者和IC患者之間沒有顯著差異，但在HBeAg陽性患者中有比HBeAg陰性患者和健康對照更高的FBP1。
本文，研究者對慢性HBV感染自然進程的患者血清進行了TMT蛋白質組學檢測。隨后，通過生物信息學分析篩選出差異蛋白（DEP）。最后，研究者通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）評估臨床樣本，驗證了慢性HBV感染進程中的DEP。作者的結果提供了區分感染HBV不同階段的潛在生物標志物，有助于開發新型生物標志物和治療慢性HBV感染的靶標。
吉凱助力
本研究的TMT血清蛋白質組學由吉凱基因提供技術服務。
·蛋白質組學平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質譜儀，專業的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質組等檢測服務，強大的機器學習算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務，系統的生物標志物、分子分型、藥物靶點、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規測序服務和單細胞測序服務：單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞TCR/BCR、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉錄組測序等服務；常規測序服務提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙?；揎棞y序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務