編者按

 中性粒細胞是進化上保守的先天免疫細胞，在宿主防御中起著關鍵作用。斑馬魚作為研究中性粒細胞在感染和腫瘤發生中的常用模型，為中性粒細胞功能的研究做出了重大貢獻，但迄今為止，斑馬魚中性粒細胞在成熟過程中的轉錄狀態和體內相關功能尚未映射到它們在人類上的對等物，從而限制了跨物種比較。

今天，我們分享2024年2月27日由奧地利維也納圣安娜兒童癌癥研究所Florian Halbritter團隊在《Nature Communications》雜志上發表的最新研究，該研究揭示了骨髓轉移性腫瘤細胞浸潤與成熟中性粒細胞總體增加之間的關聯，通過生成和分析代表不同中性粒細胞分化階段的轉基因斑馬魚菌株，展示了中性粒細胞成熟的高分辨率轉錄譜，為研究不同物種在健康和疾病的不同階段的中性粒細胞功能提供了寶貴資源。

文章題目

Comparative transcriptomics coupled to developmental grading via transgenic zebrafish reporter strains identifies conserved features in neutrophil maturation

雜志：Nature Communications（IF=16.6）

發表時間：2024年2月27日

作者：Florian Halbritter、Martin Distel等

單位：奧地利維也納圣安娜兒童癌癥研究所等

01、研究背景

中性粒細胞是人類中最豐富的免疫細胞群，也是對損傷和感染的第一反應者。在哺乳動物中，中性粒細胞在骨髓(BM)中成熟，這是造血干細胞通過粒細胞-單核細胞祖細胞向中性粒細胞分化的級聯過程的最后步驟。從早幼粒細胞到分段中性粒細胞階段的整個發育過程中形成特征性顆粒。C/EBP家族的轉錄因子是顆粒酶表達的關鍵因子。長期以來，表面標記物表達、核形態和顆粒含量一直被用來定義中性粒細胞成熟階段，但最近使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和蛋白質組分析（CyTOF）的研究對這種分類方案提出了質疑，而提出了一系列連續轉錄階段。

中性粒細胞在不同成熟階段的功能多樣性仍有待研究。不同成熟狀態的潛在作用在癌癥中變得明顯，其中未成熟的中性粒細胞經常在血液和腫瘤中積聚，并且可能改變效應功能，例如吞噬作用減少、ROS產生、NETosis、粒度、趨化因子受體表達和抑制功能增加?，F在已知中性粒細胞幾乎參與癌癥的每個階段，如腫瘤起始的ROS產生、生長、血管生成和轉移前生態位的調節。已經觀察到不同的腫瘤相關中性粒細胞（TAN）群體被TGF-β或IFN-β極化為促腫瘤或抗腫瘤作用。有趣的是，它們在癌癥進展中的相反作用與不同的成熟階段和密度有關。

斑馬魚是研究中性粒細胞在感染和腫瘤發生中的功能的通用模型，這得益于許多熒光轉基因系的可用性和活體成像的前景。斑馬魚的造血發生在腎髓中，腎髓中存在所有已知的人類主要免疫細胞類型，并且通常被認為是進化上保守的。然而，迄今為止，斑馬魚中性粒細胞在成熟過程中的轉錄狀態和體內相關功能尚未映射到它們在人類上的對等物，從而限制了跨物種比較。由于技術困難，中性粒細胞在許多人類數據集中的代表性不足，以及缺乏合適的斑馬魚品系，無法有效分選包含多個成熟階段的中性粒細胞，因此比較轉錄組學研究受到阻礙。

02、研究成果

1.  Mmp9轉基因鑒定斑馬魚成熟中性粒細胞

為了在體內區分未成熟和成熟的中性粒細胞，研究者在mmp9（Tg（BACmmp9：Citrine-CAAX）vi003)調控元件的控制下，培養了表達膜導向黃嘌呤的轉基因斑馬魚。Tg(BACmmp9:Citrine-CAAX)vi003斑馬魚胚胎/幼魚在受精后2天(dpf)在尾鰭上皮和遠端腸道中進行了mmp9轉錄。此外，沿頭部、卵黃和尾側造血組織(CHT)出現明顯的點狀圖案，提示在白細胞群中表達。研究者證實，通過檢測facs純化的Citrine+細胞中而非Citrine-細胞中的mmp9 RNA, Citrine熒光特異性報告了mmp9的表達。

為了研究Mmp9+白細胞的身份，將mmp9：Citrine魚與雙轉基因魚雜交，獲得骨髓標記物Tg(lysC:CFP-NTR)vi002(標記中性粒細胞)和Tg(mpeg:mCherry)gl23(巨噬細胞)。三轉基因幼魚在3和5 dpf時的實時成像證實了Mmp9和Mmp9+ lysC:CFP+中性粒細胞亞群的存在，其在頭部的共定位比在尾端造血組織區域更為明顯。Mmp9+ LysC+細胞mpeg:mCherry表達較低，而真實巨噬細胞mpeg:mCherry表達高度陽性(信號強度高2.5倍)，后者中很少有Mmp9表達可檢測到。LysC+ Mpeg+ Mmp9+三陽性中性粒細胞在3 dpf時在頭部區域富集(平均= 36%;范圍= 24.3−52.3%)，以及在5 dpf時的頭部和尾部（平均值=37%;范圍=29−46.8%;和32%，范圍=20.5−40%），而CHT種群從3 dpf到5 dpf下降（從平均值=20%，范圍=11.1−30.3%，到13%，范圍=10−17.6%）。頭部三陽性中性粒細胞的優勢定位表明rbi來源的頭部中性粒細胞比hsct來源的中性粒細胞成熟得多。

流式細胞術的補充分析顯示，15.4%（平均值;范圍：12.4−17.1%）的髓樣細胞表達Mmp9;其中67%（平均值;范圍61.8−69.5%;Q2）屬于LysC+Mpeg+中性粒細胞群。LysC+ Mpeg-中性粒細胞部分的citrine陽性細胞較少(平均= 29.06%;范圍:25.8−34.8% Q1)和Mpeg+ LysC-巨噬細胞(平均= 3.9%;范圍2.8−5.8%;第三季度)的人口。Mmp9的表達僅限于用蘇丹黑染色的細胞亞群，蘇丹黑是成熟中性粒細胞中存在的親脂性染料標記顆粒。此外，與Mmp9-細胞相比，Mmp9+細胞顯示出增加的側散點(SSC)，表明更高的粒度和細胞內復雜性，這表明表型成熟。

損傷后細胞行為的延時成像顯示，LysC+ Mmp9+和LysC+ Mmp9-中性粒細胞都具有類似的圓形形態，并且像中性粒細胞一樣以變形蟲般的運動快速進出傷口32 (Supplementary Movie 1)。相比之下，Mpeg+細胞顯示出巨噬細胞的典型突起，并保持在傷口邊緣附近。

成年斑馬魚的整個腎骨髓(硬骨魚的主要造血器官)以及脾臟和血液中都檢測到LysC+ Mmp9+中性粒細胞。研究者在染色的細胞自和電子顯微鏡下研究了來自WKM的facs分類的LysC+ Mmp9+和LysC+ Mmp9-群體的形態和成熟等級，只有3%(平均，范圍= 0 - 9%)的Mmp9-細胞含有分節細胞核，而23%(平均，范圍= 3 - 47%)的Mmp9+細胞含有分節細胞核，表明后者成熟程度較高。LysC+ Mmp9HI中性粒細胞的細胞大小也比mmp9細胞小，這是進一步分化階段的另一個參數。LysC+ Mmp9HI細胞的超微結構顯示出更發達的雪茄狀顆粒，而Mmp9-細胞的顆粒通常更圓。

總的來說，數據表明，Mmp9是斑馬魚成熟中性粒細胞的合適標記，與之前的人類細胞數據一致。

圖1 mmp9:黃嘌呤識別成熟中性粒細胞

2.  Mmp9+中性粒細胞具有高度吞噬性，并迅速募集到傷口中

當斑馬魚幼魚腹鰭受傷時，Mmp9HI中性粒細胞徑跡更靠近傷口(平均為8.3µm HI, 45.8µm NO, 43µm INT;n = 6)，運動線性度較低(平均= 0.23 HI, 0.42 NO, 0.39 INT;n = 6)與Mmp9INT或NO細胞相比，它們的速度相似(平均= 0.055µm/s HI, 0.045µm/s NO, 0.053µm/s INT)(圖2a−d)。

中性粒細胞的吞噬能力隨著成熟程度的增加而增加。研究者通過將活的mccherry標記的大腸桿菌注射到2 dpf Tg(lysC:CFPNTR)vi002/ Tg(BACmmp9:Citrine-CAAX)vi003幼魚中進行了體內吞噬實驗。兩個中性粒細胞亞群，LysC+ Mmp9-和LysC+ Mmp9+，都能夠攝取細菌并產生活性氧。通過流式細胞術觀察到的mCherry(大腸桿菌)和CFP(中性粒細胞)熒光重疊顯示，與Mmp9中性粒細胞相比，Mmp9+中性粒細胞攜帶細菌貨物的比例顯著高于Mmp9中性粒細胞(平均值分別為23.8%和10.7%);N = 5;配對t檢驗，P = 0.007)。此外，Mmp9+中性粒細胞更有效地募集到細菌感染部位(67.3%的Mmp9+ vs. 32.7%的LysC+中性粒細胞在感染部位;N = 33;配對t檢驗;P = 0.002)，感染期間Mmp9+細胞的總頻率增加(感染后平均為56.4%，PBS處理后平均為39.2%，n = 5;配對t檢驗;P = 0.009)。

接下來，研究者檢查了腫瘤前黑色素瘤模型中的中性粒細胞 （Et（kita：GAL4）HZM1型x Tg（HRAS_G12V：UAS：CFP）VI004)。在感染期間，研究者發現Mmp9+細胞增加(HRASG12V存在時Mmp9+平均為46.0%，對照組為37.4%;N = 5;配對t檢驗;P = 0.005)。

透明斑馬魚幼魚的實時成像顯示，一些Mmp9+細胞通過細繩與轉化細胞保持接觸，而另一些細胞則在很長一段時間內相互作用，這與之前關于LysC+中性粒細胞的數據一致。研究者發現一些中性粒細胞緊密接觸、擴散，爬過HRASG12V+細胞，似乎掃描了它們的表面。這些中性粒細胞運動的細胞足跡追蹤HRASG12V+簇的輪廓。值得注意的是，這種在HRASG12V+細胞周圍的擴散行為在Mmp9HI細胞中顯著增強(平均56.5%;N = 8;單因素方差分析，P = 0.0022)，與Mmp9INT(17.3%)或Mmp9-(17.9%)細胞相比。

總之，研究者觀察到mmp9轉基因表達與中性粒細胞的高成熟等級相關，具有增強的效應功能，如細菌感染期間的募集和吞噬作用以及與癌前細胞的相互作用增強。

圖2 Mmp9+中性粒細胞顯示成熟中性粒細胞的功能

3.  單細胞轉錄組學定義斑馬魚中性粒細胞成熟階段

為了在分子水平上仔細觀察斑馬魚中性粒細胞的成熟，并與哺乳動物進行跨物種比較，研究者對WKM和LysC+中性粒細胞群體進行了基于液滴的scrna測序，這些中性粒細胞群體表達不同的Mmp9水平(NO, INT, HI)，從兩個成年Tg(LysC:CFPNTR)vi004/ Tg(BACmmp9:Citrine-CAAX)vi003的WKM中分類。生成的數據集由18,150個通過質量控制的細胞組成。

來自WKM的中性粒細胞群和中性粒細胞在研究者的數據集中重疊，表明研究者的分選策略捕獲了WKM中存在的所有中性粒細胞。為了研究成熟動力學，研究者基于兩個獨立參考數據集的生物信息學映射，重點關注一致標記為中性粒細胞的細胞（n= 15,876個細胞），并使用Slingshot算法推斷底層軌跡的結構。使用其他軌跡推理算法也獲得了一致的結果，該軌跡的有效性和方向性由（i）沿軌跡排序的亞群的順序(依次為:Mmp9NO, Mmp9INT, Mmp9HI)，（ii）溶菌酶C（lyz）水平降低，mmp9水平升高，以及 （iii） 循環細胞數量的減少（使用Seurat包的CellCycleScoring 函數進行生物信息學推斷。從主要中性粒細胞群中分離出來的簇主要由G2/M期的細胞形成（用*標記）。

研究者使用了tradeSeq40定義中性粒細胞成熟相關基因的算法（P調整后< 0.05，根據 Wald 統計量按降序排列前 1500 名）.根據這些基因的表達模式，研究者將細胞沿著軌跡分為四個成熟階段（P1 = 早期，P2 = 早期/中期，P3 = 中期/晚期，P4 = 晚期）。同樣，研究者將基因分為三個模塊（M1 = 早期，M2 = 中間，M3 = 晚期）。雖然M1和M2幾乎分別在P1期和P2期表達，但M3基因在P3和P4期均表達。使用hypeR進行功能富集分析41表明早期的模塊M1和M2與細胞周期和增殖有關，而模塊M3包含與成熟中性粒細胞功能相關的基因，如遷移、免疫激活和炎癥。

接下來，研究者詳細檢查了與某些中性粒細胞功能相關的基因。首先，研究者發現在早期成熟（P1）期間表達的增殖因子myca，而提前成熟（P3，P4）與抗凋亡基因（如mcl1a，mcl1b和mxi1）相關，mxi1是myc的負調節因子42。其次，研究者檢測到與氧化應激反應相關的基因（selenoh43、ABCC13、PRDX1），在P1的早期，這些基因有助于保護祖細胞免受氧化損傷。第三，研究者發現P4中骨髓潴留因子cxcr4b下調，相反，P4中cxcr1、lyn和遷移相關轉錄因子atf3上調，這與推測的遷移表型轉換一致。

最后，研究者還發現了編碼在特定階段表達的顆粒相關蛋白的基因，這些顆粒通常用于哺乳動物的中性粒細胞分期5。在軌跡開始時，從P1開始，從P2開始的初級顆粒相關基因cd63、srgn和mpx，從P3開始的次級顆粒相關NADPH氧化酶亞基cybb和cyba，以及明膠酶mmp9和mmp13a.1(一個假定的人類MMP1的同源物)在P4。這些基因的表達與人類中性粒細胞從成髓細胞(P1)到早幼髓細胞(P2)和髓細胞/變髓細胞(P3)到帶狀/分節中性粒細胞(P4)的分期一致。最后一個階段(P4)也與促炎細胞因子il1b的上調有關，證實了小鼠中性粒細胞的數據。

綜上所述，研究者的數據表明，斑馬魚腎髓中的中性粒細胞在從增殖階段到有絲分裂后、抗凋亡和遷移階段的連續過程中成熟；與某些顆粒類型相關的基因檢測表明，顆粒的產生序列與哺乳動物相似。

圖3 斑馬魚中性粒細胞的scrna序列揭示一個連續的成熟過程

圖4 軌跡分析揭示潛在的細胞階段和控制基因模塊

4. C/ebp-β 控制成熟過程中晚期顆?；虻谋磉_

接下來，研究者試圖確定斑馬魚中性粒細胞成熟過程的關鍵調節因子。許多已知的中性粒細胞TFs沿軌跡顯示出動態表達模式。研究者推斷，關鍵調控性TF的表達與其靶基因的表達密切相關，盡管可能存在時間延遲。因此，研究者使用動態時間翹曲(DTW)分析比較了TF表達與每個模塊中基因的表達，其中突出顯示了ybx1，也稱為關鍵剪接因子，hmgb2b和dnajc1作為模塊 M1 中早熟基因的主要調節因子。相比之下，cebpb和atf3是最重要的遲成熟(M3)轉錄因子。

研究者假設C/ebp-β參與了斑馬魚中性粒細胞成熟的調控。經證實，cebpb在分選的LysC+ Mmp9+中性粒細胞中的表達顯著高于LysC+ Mmp9-中性粒細胞和未分選的細胞中的表達后（重復測量方差分析，P < 0.05），研究者使用已發表的 AUG 結合嗎啉基靶向cebpb翻譯。未觀察到全身不良反應，敲低不影響穩態中性粒細胞數量，與先前的數據一致。研究者檢查了C/ebp-β是否調節Mmp9+中性粒細胞的吞噬功能增強，但發現對mCherry標記的大腸桿菌的攝取沒有影響。在facs分類的LysC+ mmp9+中性粒細胞中，Cebpb敲低影響已發表的C/ebp-β靶基因14、mmp9和fcer1gl的表達，但不影響spi1b和mcl1a的表達。

值得注意的是，研究者發現cebpb嗎啉處理降低了LysCMmp9中性粒細胞在2dpf和3dpf的頻率，表明C/ebp-β在向表達Mmp9的成熟中性粒細胞分化中的指導作用。相反，cebpb RNA過表達導致更高的LysCMmp9中性粒細胞頻率和mmp9表達水平，進一步支持這一作用。

為了確認C/ebp-β在成體中性粒細胞中的功能，研究者通過CRISPR-Cas9引入76 bp的缺失和2 bp的插入，導致移碼和過早停止密碼子，產生了cebpbMUT vi006魚。與幼魚的結果一致，研究者觀察到純合子cebpbMUT vi006魚的WKM中LysC+ Mmp9+群體明顯減少(在Mmp9中:CitHOM平均= 1.4%;在mmp9中:CitHET平均值= 5.1%)與cebpbWT相比(在mmp9中:CitHOM平均值= 32%;在mmp9中:CitHET平均值= 25.1%)，但LysC+中性粒細胞的頻率沒有變化。

總之，這些數據表明，C/ebp-β -除了在需求驅動的造血中發揮作用外，還調節穩態中性粒細胞成熟的各個方面，如成熟的Mmp9+中性粒細胞的產生和顆粒蛋白的表達，但不是它們的吞噬功能。

圖5 Cebpb表達與斑馬魚中性粒細胞成熟有關

圖6  Cebpb調節斑馬魚中性粒細胞成熟后期的各個方面

5. 跨物種比較可以對斑馬魚中性粒細胞成熟階段進行分期并識別保守的基因特征

接下來，研究者想測量斑馬魚和哺乳動物物種之間中性粒細胞成熟軌跡的保守性，這是研究和模擬跨物種粒細胞生成的重要信息。為了解決這個問題，研究者收集了轉錄組數據集，這些數據集捕獲了人類和小鼠的祖細胞、早期和晚期中性粒細胞成熟階段。研究者在此選擇中納入了體內和體外數據。然后，研究者遵循兩種互補的方法來評估細胞和分子水平的相似性。

首先，研究者將所有數據集與我們在斑馬魚中定義的中性粒細胞成熟的四個階段整合在一起(聚集每個階段單個細胞的轉錄組譜)，并使用無監督的分層聚類以無偏的方式對相似的階段進行分組。研究者發現P1階段聚集在人類體外分化的早期階段(Neu3h-12h51)和小鼠(ly6c_neg_gmp13, preNeu11, proneu1 /250, proneu113)和人(NCP1-448, eNeP49)的單能性中性粒細胞前體和早期中性粒細胞。P2期對應于過渡階段，包括小鼠的preNeu-150和proeu213，早幼粒細胞(PM)48，髓細胞(MY)48和N1-中性粒細胞(不包括早期祖細胞部分(“N1 w/o eNeP”)49)。最后，P3期和P4期聚集了到達體外分化終點的細胞(Neu96h)51和Muench等人2020 (immNeu)50描述的分化和mmp9陽性的小鼠中性粒細胞，以及帶狀細胞(BC)。從外周血中捕獲的其他細胞(blood_neu11, mature_neu11, neus49)以及分節中性粒細胞(SN)48和PMN48也在P3-P4階段與斑馬魚中性粒細胞聚集在一起，盡管距離更遠，這與離開骨髓后的持續成熟一致，這一過程在斑馬魚WKM中性粒細胞數據中缺失。總之，這一分析表明，斑馬魚的四個階段反映了小鼠和人類中性粒細胞成熟的主要階段。

其次，基于已發表的骨髓scRNA-seq數據，研究者通過比較斑馬魚模型與小鼠模型和人類模型的成熟軌跡，查詢所有物種的中性粒細胞成熟在轉錄組水平上是否遵循相似的動態。對于每條軌跡，研究者使用相互關聯的方法將成熟軌跡上的基因表達模式與斑馬魚軌跡上相應的同源物對齊。研究者發現基因在早期發育中的表達（M1ortho）在所有數據集中都與他們的小鼠和人類直系同源物高度一致。在后期階段（M2ortho和 M3ortho模塊），表達譜存在分歧，但發現每個模塊中的基因子集在所有數據集中都是保守的。例如，該分析證實了三個物種中已確定的M1（ybx1）和M3（cebpb）候選調節因子的強烈一致性。

與一些人類（Tabula Sapiens 和 Xie 2021）和小鼠（Grieshaber−Bouyer 2020）數據集相比，斑馬魚的 mmp9表達略微滯后，這些數據集包含未在研究者的 WKM 分離株中分析的外周中性粒細胞。相反，其他基因顯示出物種特異性差異;例如，與斑馬魚相比，TGFBI在人類中表達得更早，但在小鼠軌跡中表達得更晚。與斑馬魚相比，其他基因顯示出滯后（例如，txnipa）或提前（例如，amd1）。

為了評估物種水平上成熟軌跡的相似性，研究者計算了每個模塊的每個數據集的平均互相關系數，并使用分層聚類對具有相似成熟動態的數據集進行分組。研究者發現M1ortho和M2ortho的相互相關滯后范圍小于M3ortho，所有數據集之間的差異都增加了。綜上所述，這些結果表明，中性粒細胞早期成熟具有很強的保守性（在所有物種中），而差異出現在成熟后期階段。

作為外部驗證，研究者試圖比較研究者的直系同源基因模塊（M1ortho-M3ortho）到人類未成熟中性粒細胞的常用基因特征（HAY_BONE_MARROW_IMMATURE_NEUTROPHIL;M39200）。令人驚訝的是，大多數假定的“未成熟中性粒細胞”基因可歸因于斑馬魚中性粒細胞成熟的晚期模塊(M2ortho, M3ortho)，但也對人類體外中性粒細胞分化的晚期時間點，強調了不同成熟等級的替代基因特征的必要性。研究者的跨物種比較使研究者能夠定義中性粒細胞成熟的泛物種基因特征（(絕對交叉相關滯后<= 50;M1pan = 304, M2pan = 176, M3pan = 122)。

最后，研究者繼續展示了泛物種中性粒細胞成熟特征的效用，用它來從大量RNA測序數據中推斷異質組織中中性粒細胞的成熟階段。為此，研究者分析了轉移性神經母細胞瘤樣本。神經母細胞瘤是一種源自交感神經系統的兒童癌癥，經常播散到腦基底膜。因此，將BM與（n= 17個數據集）和沒有腫瘤細胞浸潤（n= 21個對照）進行比較，提出了一個體內測試用例來檢查研究者的基因模塊。單樣本基因集富集分析(ssGSEA)57顯示對照樣本中早期模塊(M1pan和M2pan)的富集差異，而腫瘤浸潤樣本中成熟模塊M3pan的富集差異。

為了驗證，我們用成像細胞計數法(IMC;銥嵌入物=核;CD15 =粒細胞)。這證實了與對照組相比，轉移組的節段性中性粒細胞顯著增加(Unpaired t檢驗;P = 0.025)。

圖7 斑馬魚、小鼠和人類表達軌跡的一致性揭示了成熟階段的一致性和差異性

圖8 泛物種中性粒細胞成熟特征顯示轉移性神經母細胞瘤患者骨髓中成熟中性粒細胞的富集

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