溶瘤病毒種類

Ad5型溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus，OAd)以基因組簡單，研究較深入而獲得廣泛應用，我國OAd/所有溶瘤病毒在研占比為40.5%。Ad5基因組為線形雙鏈DNA，大小約為36 kb，分為早期（ElA、ElB、E2、E3、E4、Ⅸ和Ⅳa2）和后期（Ll～L5）轉錄單元。

腺病毒基因組

OAd作為治療腫瘤的新型技術，其優化設計主要圍繞溶瘤性、安全性思路進行，針對病毒基因組進行工程化改造：

OAd特性

OAd特異性殺傷示意圖

OAd改造原理如下：

1. E1A-CR2缺失

E1A是最早被轉錄的片段，是起始病毒復制的關鍵分子，具有抑制某些癌基因和激活某些抑癌基因， 降低癌細胞在體內的致瘤性及抗轉移等活性。

E1A蛋白包含三個保守區域CR1、CR2、CR3,E1A-CR2區可結合視網膜細胞瘤突變基因（RB1-抑癌基因,在眾多的癌腫里處于突變狀態，因于眼部惡性腫瘤發現而得名），促使細胞復制進入S 期，為病毒復制提供條件。

腫瘤普遍存在RB調控缺陷，因此，刪除CR2不影響OAd在腫瘤細胞的復制，而正常細胞由于RB的調控遏止了E1A驅動的細胞周期調控，達到特異性的在腫瘤細胞內復制的效果^[1]。

E1A-CR2缺失

2. E1A-特異性啟動子調控

病毒于腫瘤細胞的選擇性復制是通過特異性的腫瘤組織啟動子，來控制病毒增殖必需基因的表達而獲得。將腫瘤組織特異性啟動子（TSP）取代E1A基因自身的啟動子，使其只能在腫瘤細胞內表達，而在正常細胞內處于低表達或者不表達狀^[2]。
TSP包含兩類：

1. 廣譜性腫瘤特異性的啟動子：這類啟動子在所有的腫瘤細胞中表達，如survivin 啟動子、環氧化酶(COX-2) 啟動子、hTERT 啟動子；

以hTERT為例說明：端粒酶在大多數惡性腫瘤細胞中處于激活狀態而在正常細胞中沒有活性或活性很低，是目前所報道最為廣譜的腫瘤生物分子標記。利用端粒酶逆轉錄酶啟動子來調控病毒復制增殖所必需的基因，理論上可使病毒選擇性在端粒酶陽性的腫瘤細胞中增殖。

2. 針對特定腫瘤的啟動子：此類啟動子只在特定腫瘤細胞表達，如：

前列腺特異性抗原（PSA）啟動子、甲胎蛋白（AFP）肝癌啟動子、癌胚抗原（CEA）上皮癌啟動子。

二、E1B改造
E1B包含E1B-19K、E1B-55K兩個蛋白，與細胞周期調控相關：

1. E1B-55 K

腺病毒在細胞內復制會激活TP53介導的凋亡通路，而E1B-55K可結合TP53，使之失活，從而抑制被感染細胞的凋亡。缺失了E1B-55K的腺病毒將不能在TP53功能正常的細胞內有效復制，而在TP53基因突變、缺失或功能失活的細胞內卻能大量復制并裂解殺傷細胞(大部分腫瘤的發生伴隨TP53抑癌基因的功能缺失)^[1]。

2. E1B-19K

E1B-19K所編碼產物功能與抗凋亡因子BCL-2類似，抑制被感染細胞死亡，允許病毒復制。19K的缺失能夠通過多途徑誘導腫瘤細胞凋亡，增強病毒傳播能力[3]。早期OAd病毒以缺失55k為主，而同時刪除19k+55k不僅可以增加病毒靶向性，還能提高病毒的促凋亡能力。

E1B蛋白機制

三、E3改造
E3編碼抑制抗病毒免疫應答的蛋白,參與病毒宿主相互作用，可減弱被感染細胞被機體免疫識別的概率。E3區含有多個蛋白E3-12.5K,6.7K,gp19k,ADP,RID等，且改造出現以下幾種分歧：

保留E3

E3的存在賦予了早期細胞破壞和后代釋放的優勢，這是體內有效溶瘤效應所必需的，而E3區域的缺失導致病毒基因表達下降，復制減弱，病毒清除加速和抗腫瘤效果降低。

刪除gp19k

gp19 kDa蛋白抑制MHC I類分子的表達，避免感染細胞被效應T細胞識別，該段缺失表現為病毒復制以及抗腫瘤效果增加。

刪除E3B

E3B保護感染細胞免于因TNF，TRAIL，FasL介導的凋亡作用，刪除可促進凋亡，引發急性炎癥作用。

刪除ADP

ADP即死亡蛋白，可促進細胞溶解，介導病毒釋放。刪除該蛋白可減緩病毒釋放進程，從而增加病毒在細胞中的復制數量。

E3改造策略

E3區域的個性化改造表明：針對不同的腫瘤，E3區域的改造顯示出差異性的溶瘤效果。目前，絕大多數進入臨床實驗的為E3B缺失。

E3結構示意圖

四、聯合應用

前三點為基礎的OAd改造策略，OAd還可作為載體構建外源免疫相關基因，或者聯合傳統放化療、生物療法如CAR-T、單抗等，通過多種途徑協同作用殺傷腫瘤細胞。所涉及的改造技術點總結如下：
OAd共表達免疫刺激基因

包括細胞因子IL-12、IFN-γ、GM-CSF，趨化因子CCL5和HSP等：募集免疫效應細胞，增強抗腫瘤免疫應答^[4][5]

OAd共表達siRNA

將原癌基因或者免疫抑制基因進行敲減，增強抗腫瘤作用。如PD1、K-RAS等^[6]

OAd聯合殺傷

OAd聯合CAR-T、單抗、化療、放療等其他治療手段，協同抗腫瘤，達到更好的治療效果^[7]

修飾OAd外殼蛋白(Fiber)

Fiber改造的病毒可提升病毒感染效率或靶向特定器官，提升治療效果。如RGD修飾的Fiber可解決腫瘤低表達柯薩奇受體引發的感染低效的問題^[8]

采用修飾或者非人源外殼包裝OAd

逃避中和抗體，減弱免疫對腺病毒的滅活效應^[9]

OAd與CAR-T類似，個性化程度較高，針對不同的腫瘤，聯合不同的手段呈現的結果也不盡相同。以上的五點策略均可從前人的研究中獲得直接的數據，若數據或者結果不理想，可參考M1溶瘤病毒的研究方法，將溶瘤病毒與400余種小分子抗腫瘤化合物聯合使用篩選，獲得最佳組合方式。

OAd作為新型的治療手段，也有不足點：

1. OAd對腫瘤的特異性殺傷能力還有待提高，在腫瘤發生的早期，腫瘤細胞與正常細胞異質性較小，導致OAd復制及殺傷能力較弱。

2. OAd目前限于腫瘤原位注射，無法根除轉移瘤。合理、高效的給藥方式有待進一步開發。

3. 人體本身對病毒的排斥反應降低了溶瘤效果；病毒高效的靶向性有待進一步提升，這些都需要對病毒本身進行系統的研究開發。

盡管OAd在治療腫瘤中還存在不足，但臨床研究證實，腺病毒治療腫瘤的安全性和前瞻性毋庸置疑(相比逆轉錄病毒隨機插入的的致癌風險)。未來十年將是我國創新藥高速發展的階段，目前已有超200種在研的溶瘤病毒，其中近10個自主研發的溶瘤病毒產品進入臨床研究階段，相信溶瘤病毒、CAR-T、TCR-T這些新興的生物療法會大放異彩，為更多的腫瘤患者帶來福音。

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【參考文獻】

1.Oncolytic adenoviral mutants induce a novel mode of programmed cell death in ovarian cancer

2.Oncolytic viruses driven by tumor-specific promoters

3.Oncolytic Adenoviral Mutants with E1B19K Gene Deletions Enhance Gemcitabine-induced Apoptosis in Pancreatic Carcinoma Cells and Anti-Tumor Efficacy In vivo

4.A novel combination treatment of armed oncolytic adenovirus expressing IL-12 and GM-CSF with radiotherapy in murine hepatocarcinoma

5.Targeting the intratumoral dendritic cells by the oncolytic adenoviral vaccine expressing RANTES elicits potent antitumor immunity

6.Antitumor activity of an oncolytic adenovirus-delivered oncogene small interfering RNA

7.Improving CART-Cell Therapy of Solid Tumors with Oncolytic Virus–Driven Production of a Bispecific T-cell Engager

8.Enhanced Transduction and Replication of RGD-Fiber Modified Adenovirus in Primary T Cells

9.Oncolytic adenovirus based on serotype 3

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