想必在每個學生物的人眼中PCR這個詞絕對不陌生，簡單的描述為：幾個東西加一起，混一混，上個PCR儀就可以坐等產物了?？雌饋?/span>so easy，但想成就PCR不敗記錄，擴增出各種不同序列，并且擴出來的條帶特異性良好，還是需要點功夫的，今天我們就來介紹一下簡單又不簡單的各種PCR吧！
高GC含量PCR（GC-rich PCR）
具有高GC含量（>80%）的模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。高GC含量序列同時也涉及二級結構。因此，高GC含量序列使DNA聚合酶在擴增時卡住，從而影響了DNA的合成。
為了擴增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強GC相互作用，最常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性，如DMSO。這些試劑通常會降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應的調整。
高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強結合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴增。高熱穩定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴增，因為更高的變性溫度，如98℃代替95℃，可促進解鏈和PCR擴增。
長片段PCR（Long PCR）
長片段PCR通常指擴增大于5 kb的DNA片段。長片段PCR傳統上使用Taq DNA聚合酶（為了快速延伸）和高保真酶（為了準確度）的混合物。
隨著高合成能力、高保真DNA聚合酶的發明，長片段PCR現在可在短時間內高準確性的完成。通過與一個強DNA結合蛋白的結合，聚合酶可獲得高擴增能力，可在短時間內擴增長片段，如>20 kb gDNA片段。除此之外，極高保真度，如>100xTaq，可確保長片段擴增的低錯誤率。
當擴增>10 kb的片段時，PCR實驗方案可能需要在以下5個關鍵位置進行適當優化：
1. 確保使用高質量、高純度的DNA樣本。
2. DNA聚合酶的熱穩定較低，使用更多量的DNA聚合酶以彌補多次循環中的聚合酶活性損失。
3. 降低退火和延伸步驟的溫度，以助于引物結合。
4. 適當增加PCR步驟的時間，以促進模板DNA的完全分離及引物的結合。
5. 適當增加PCR延伸時間確保目的片段的全長擴增。
熱啟動PCR（Hot Start PCR）
熱啟動PCR常用于增強PCR擴增的特異性。熱啟動PCR主要借助一種酶的修飾物，如抗體、親和配體、適體或化學修飾物，來抑制常溫下DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR反應體系配制階段引物與模板、引物與引物之間的結合能力降低，從而避免了非特異性擴增。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動技術為在常溫下配制多個PCR反應體系提供了極大的便利，而無需犧牲PCR反應的特異性。當反應體系配制好后，在反應初始加熱時，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活。激活時間和溫度根據DNA聚合酶及熱啟動修飾物的不同而有所差別。對于某些聚合酶，激活和預變性合并成了一步。
降落PCR（Touchdown PCR）
另一種提升PCR反應特異性的方法是調整PCR循環的參數。在降落PCR中，前幾個循環的退火溫度設定為比引物的最高退火溫度（Tm）再高幾度。較高的溫度有助于避免產生引物二聚體及非特異性引物與模板形成的復合物，因此可以減少不希望出現的擴增。就這一點來說，較高的退火溫度可減少非特異性PCR產物，在PCR起始階段促進特異性的擴增。
雖然較高的退火溫度可阻止引物二聚體形成和非特異性引物結合，但同時較高的退火溫度會加劇引物與目標序列的分離，導致PCR的產量降低。為了克服這個問題，在開始的幾個循環中，退火溫度通常設置為每個循環降低1℃，以獲得足量的預期擴增子。當退火溫度降低到最佳溫度時（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循環都維持此退火溫度。通過這種方法，在PCR過程中，所期望的PCR產物得到有選擇性的增加，而幾乎不會出現非特異性的產物。
巢式PCR（Nested PCR）
巢式PCR是常規PCR的一種演變，其增強了反應特異性和目標擴增子的產量。在此方法中，需要設計兩對引物：一對（外引物）在目標擴增區域的側翼，而另一對引物（巢式引物）對應于所擴增DNA的準確區域。第一輪PCR的產物之后作為第二輪PCR的模板。如果第一對引物（外引物）由于引物錯配擴增出了非特異性產物，第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低，所以通過第二對引物的擴增，PCR的特異性得到了提升。進行兩輪PCR的另一個好處是這種方法有助于從有限的起始DNA中擴增得到足量的產物。
多重PCR（Multiplex PCR）
多重PCR可實現在同一反應管中同時擴增多個不同的片段。多重PCR不僅意味著節約時間、試劑和樣本，同時使得多個擴增子進行同時比較成為可能。當一個反應管中存在多個引物對時，如在多重PCR中，非特異性擴增和擴增效率的降低是最關注的問題，因為反應的優化不可能針對所有的引物對和片段。因此，引物的設計至關重要，以減少錯配引起的非特異性擴增。
引物序列對于目標片段應該是獨特的，且所有引物的Tm值差異應在5℃內。在進行多重PCR前，每個引物對應在單個反應中驗證其特異性和擴增效率。而且，不同大小的擴增子應在凝膠電泳中可區分開，以便鑒定。除了引物設計和擴增子大小，熱啟動DNA聚合酶和特殊優化的PCR緩沖液對于多重PCR也是必需的，它們有助于擴增的成功率和擴增的特異性。