整合多組學策略的進展，如蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學結合基因組學研究，已經推動了多種不同腫瘤的治療發展。近期，國家神經疾病醫學中心、復旦大學附屬華山醫院神經外科趙曜教授團隊和復旦大學表型組研究員、生命科學學院丁琛教授團隊對200例垂體腺瘤組織和7例對照樣本進行了多組學（基因組、轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組）檢測和分析，以揭示垂體腺瘤的蛋白基因組學特征，并基于組學結果進行疾病分子分型，為將來的垂體腺瘤的精準治療提供理論依據。研究成果以“Integrated proteogenomic characterization across major histological types of pituitary neuroendocrine tumors”為題，發表在Cell Research（IF：46.297）上。
多組學樣本分組設置及臨床特征：
基因組全外顯子測序：200例垂體腺瘤組織；
轉錄組RNA測序：194例垂體腺瘤組織+7例垂體前葉組織；
蛋白質組：200例垂體腺瘤組織+7例垂體前葉組織；
磷酸化蛋白質組：194例垂體腺瘤組織+7例垂體前葉組織；
垂體腺瘤患者的多種TF譜系、病理亞型及其他臨床特征如下：
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01
垂體腺瘤（PitNET）蛋白基因組圖景概覽
全外顯子測序（WES）檢測到了7333個突變基因，包括11092個非沉默點突變和419個小插入或缺失。研究者發現了多個和PitNET功能相關的顯著性突變基因（SMG），包括GNAS (11%)、KRT76 (8%)、TCHH (6%)、ZMIZ2 (6%)、DGKZ (6%)、KRTAP9-2 (5%)和USP8 (4%)。對體細胞堿基改變分析顯示，與其他五種替代類型相比，PitNET患者攜帶的C→A轉變的比例較高。與TCGA數據庫中的其他腫瘤相比，PitNET的腫瘤突變負荷(TMB)在33種癌癥類型中處于較低或中等水平。隨后，研究者比較了顯著性突變基因（SMG）的變異等位基因頻率(VAF)，發現USP8突變（中位數：0.45）排在第一位，其次是GNAS突變（中位數：0.36）。緊接著，研究者對突變在各PitNET亞型中的富集情況進行分析，結果顯示USP8突變在ACTH亞型中富集，而GNAS突變在多激素亞型和GH亞型中富集。體細胞CNA（拷貝數改變）分析發現染色體臂級別的擴增（Chr 5、7、8、9、12q、14q、19、20、21p）和缺失（Chr 1p、2q、11）。
轉錄組RNA測序檢測到了18397個基因（FPKM>1）。蛋白質組檢測到了10011個蛋白，其中至少在一種腫瘤亞型的50%樣本中被檢測到的6160個蛋白進入下游分析。磷酸化蛋白質組檢測到了5483個蛋白上的29219個磷酸化位點，其中至少在一種腫瘤亞型的50%樣本中被檢測到的9905個磷酸化位點進入下游分析。各組學的PCA分析顯示，在蛋白質組學上，PIT1譜系（GH、PRL、TSH、silent PIT1和多激素腺瘤亞型）和APG、ACTH、silent TPIT及其他PitNET類型有明顯區分。而轉錄組和磷酸化蛋白質組的PCA結果則顯示，PIT1譜系腫瘤與APG組有更高的相似性。
02
基因改變對轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組的影響
腫瘤組織轉錄組和蛋白質組的6115個mRNA-蛋白質對中的92.95%正相關。強相關基因富集在和神經系統、EMT、激素代謝過程相關的通路，表明這些通路在PitNET中過激活?？傮w樣本層面上的mRNA-蛋白相關性中位值為0.45，各臨床病理亞型樣本的相關性從0.42-0.46。
緊接著，研究者檢測了23109個體細胞CNA對同基因座位（cis效應）和其他基因座位（trans效應）上mRNA、蛋白和磷酸化蛋白豐度的影響。Cis效應分析發現，CNA分別影響6545個mRNA表達豐度和684個蛋白質表達豐度，其中有502個顯著性cis效應重合。這502個基因富集在蛋白翻譯后修飾、NAD+合成和代謝通路。此外，研究者發現，CNA通過cis效應影響15個腫瘤相關基因（CAG）的mRNA和蛋白質表達豐度，CNA 通過cis效應影響6個CAG的mRNA和磷酸化蛋白質表達豐度。
03
PIT1譜系腫瘤中的GNAS突變和GNAS拷貝數增加
研究者的結果中，GNAS是PIT1譜系腫瘤中頻率最高的基因突變，包含兩個突變熱點：R186C/G/L/H和Q212L。GNAS拷貝數增加，一個受到cis效應影響的腫瘤相關基因，對PIT1譜系腫瘤有重要影響。GNAS突變（VAF>5%）或GNAS拷貝數增加均富集在PIT1譜系腫瘤中。
通過整合全外顯子數據，研究者將PIT1譜系腫瘤分為三個亞群：野生型（WT）、GNAS拷貝數增加和GNAS突變。與野生型相比，有GNAS突變的樣本中，GNAS蛋白水平下調，而與GNAS拷貝數增加的樣本中，GNAS mRNA和蛋白水平均上調。與WT相比，在GNAS突變亞群中，參與生長素合成、分泌和作用通路的基因在mRNA、蛋白和磷酸化水平均上調。與WT相比，GNAS拷貝數增加亞群有更高的多基因增殖得分（MGPS）和臨床腫瘤體積。細胞周期相關分子中，PRKDC和CDK6是前兩個與GNAS拷貝數增加正相關的分子。不管是在PIT1譜系腫瘤還是所有的PitNET中，高CDK6得分的樣本占比在高GNAS拷貝數增加樣本中比在低GNAS拷貝數增加的樣本中更多。該結果提示我們，靶向CDK6的抑制劑也許是對含有GNAS拷貝數增加的PIT1譜系腫瘤有效的治療策略。
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基于多組學結果的PitNET分子分型
基于蛋白質組、轉錄組和磷酸化蛋白質組的數據分別將PitNET分為7個、5個和7個疾病亞型。7個基于蛋白質組的疾病亞型為GHenrich、 EMTPRO、 PRLenrich、TSH/silent PIT1enrich、ACTHenrich、silent TPITenrich和SF1/NULLenrich。Hedgehog信號通路在GHenrich亞型中上調，MYC targets v1在PRLenrich亞型中上調。TSH/silent PIT1enrich中富集了干擾素α響應、抗原提呈通路。SF1/NULLenrich亞型中存在代謝相關通路的上調，如脂肪酸代謝和三羧酸循環。此外，在SF1/NULLenrich亞型中，有更多的男性、更高的患者年齡和更大的腫瘤直徑。ACTHenrich亞型富集了USP8突變，ACTHenrich亞型和silent TPITenrich亞型都有更高比例的女性患者。
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05
前三大TF譜系垂體腺瘤的分子特征分析
本研究中，垂體腺瘤按TF譜系分類，患者占比前三的分別是PIT1譜系、TPIT譜系和SF1譜系，總計占比超過75%。因此，研究者對這三類垂體腺瘤中的分子特征進行了分析。
（1）在PIT1譜系腫瘤中發現了以EMT（上皮間質轉化）為特征的侵襲亞型
與其他基于蛋白質組的疾病亞型相比，在EMTPRO亞型中存在與穩態及EMT相關分子包括GP1BB、FGB、MMP8、FN1和ITGB3的高表達。EMTPRO亞型是高侵襲性的，且腫瘤直徑大。鑒于EMT在腫瘤轉移中不可忽視的作用，研究者利用轉錄組和蛋白質組數據分析了基質細胞在其中的貢獻。結果表明，不管是RNA還是蛋白質的分析結果都表明，EMTPRO亞型都有更高的基質細胞分值，該結果得到HE染色的驗證。上皮marker pan-cytokeratin和間質marker FN1的免疫熒光共染色表明，在EMTPRO亞型中有更高比例的染色面積。以上這些結果表明，EMTPRO亞型中的腫瘤細胞呈現為EMT狀態。
EMT-inducing transcription factor（EMT-TF）是EMT表型的重要驅動因子。研究者比較了PIT1譜系腫瘤中基于轉錄組分型的兩個亞型間EMT-TF的表達情況，結果表明5個EMT-TF（SNAI1、SNAI2 、ZEB2 、TWIST1 和TWIST2）在EMTRNA亞型中顯著上調。這5個EMT-TF的表達模式在EMTRNA和EMTPRO中高度正相關。
（2）在TPIT譜系腫瘤中發現3種EGFR激活模式
EGFR與多種癌癥相關，且被提示可以作為ACTH PitNET的治療靶點。研究者發現在TPIT譜系中，EGFR的mRNA表達、蛋白豐度和磷酸化修飾水平均比其他類型的腫瘤要高。通過分析EGFR相關通路，將TPIT譜系腫瘤分為3個亞群，分別為USP8突變的ACTH腫瘤、USP8未突變的ACTH腫瘤和silent TPIT腫瘤。在USP8未突變的ACTH腫瘤中，EGFR配體的mRNA顯著上調。在silent TPIT腫瘤中，EGFR T693磷酸化顯著富集。在TPIT譜系腫瘤中，EGFR表達更高，且EGFR T693磷酸化陽性率在silent TPIT腫瘤中高于ACTH腫瘤。此外，研究者還發現，4種轉錄因子可能參與了ACTH分泌和調控，或可作為新的治療靶點。
（3）SF1譜系腫瘤和NULL腫瘤存在VEGF通路和缺氧信號的激活
多組學的疾病分型分析時發現，SF1譜系腫瘤和NULL腫瘤呈現出相似的表達模式，因此合并分型為SF1/NULLenrich亞型。腫瘤相關通路的富集分析顯示，在SF1/NULLenrich亞型存在VEGF通路和缺氧信號的激活。進一步分析發現，不管是在mRNA、蛋白質還是磷酸化蛋白質水平，VEGF信號的下游信號，如RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K-AKT信號均在SF1/NULLenrich亞型中激活。相比于其他PitNET腫瘤，VEGFR2的IHC染色結果也顯示，其表達量在SF1譜系腫瘤和NULL腫瘤高表達。以上結果提示我們，靶向VEGFR2的治療方案或許是這類病人的有效治療手段。
06
PitNET的免疫浸潤特征
研究者進一步使用xCell分析了腫瘤微環境中各種細胞的占比。一致性聚類分析共得到了4種具有獨特免疫和基質特征的腫瘤類型：免疫耗竭型、CD4+T細胞浸潤型、內皮細胞型和CD8+T細胞浸潤型。CD8+T細胞浸潤型包括ACTHenrich亞型和silentTPITenrich亞型，存在EGFR信號和細胞周期通路的上調。內皮細胞型存在CSF1R、CD34和PDL2 mRNA水平的上調及FGFR1蛋白水平的上調。CD4+T細胞浸潤型中存在CTLA4的上調，提示我們此類腫瘤可能對免疫檢查點相關治療手段有響應。免疫耗竭型包括TSH/silent PIT1enrich和GHenrich蛋白亞型，存在高評分的Treg細胞和PDL1 mRNA的上調。PDL1 mRNA在TSH/silent PIT1enrich和GHenrich蛋白亞型中上調，提示我們可以嘗試使用PDL1療法。EMTPRO
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