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PP1

MCE 國際站：PP1

品牌：MedChemExpress (MCE)

貨號：HY-13804

CAS：172889-26-8

Synonyms：AGL 1872; EI 275

純度：0.99

存儲條件：粉末 -20°C 3 年 4°C 2 年 溶劑中 -80°C 2 年 -20°C 1 年

運輸條件：美國大陸的室溫；其他地方可能有所不同。

產品活性：PP1 是一種有效的選擇性 Src 家族抑制劑，抑制 Lck 和 Fyn，IC50 分別為 5 和 6 nM。

細胞實驗：純化的人外周血 T 細胞中抗 CD3 刺激的酪氨酸磷酸化的抑制測量如下。所有孵育均在 37°C 的 Eppendorf Thermomixer 5436 中進行，混合設置為 11。細胞（100 μL RPMI 1640 培養基中的 1×106）與藥物孵育 15 分鐘，然后與 1 μg 抗 CD3/mL（抗 leu4，100 μg/mL）孵育 6 分鐘。反應的最終體積為 115 μL。通過添加 57.5 μL 3× 溶解緩沖液（在添加前在 100°C 下孵育）來終止反應。將樣品混合，煮沸 5 分鐘，并儲存在 -70°C 下。在 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上對這些細胞裂解物進行蛋白質印跡分析，用多克隆抗磷酸酪氨酸抗體進行檢測，用 I 標記的蛋白 A (ICN) 檢測免疫復合物。為了進行定量分析，使用 Molecular Dynamics 激光掃描儀掃描膠片，并在抗 CD3 存在下（有和無藥物）定量主要底物帶 p70 的光密度。抑制百分比計算如下：(1-(有藥物時的 p70 光密度單位/無藥物時的 p70 單位))×100。IC50 等于測量到 50% 抑制時的化合物濃度[1]。MCE 尚未獨立證實這些方法的準確性。它們僅供參考。

激酶實驗：將 Protein A-Sepharose 珠子（制備成 50% (w/v) 懸浮液）以 250 μL/mL 的濃度加入抗體/裂解物混合物中，并在 4°C 下孵育 30 分鐘。然后將珠子在 1 mL 裂解緩沖液中清洗兩次，在 1 mL 激酶緩沖液中清洗兩次（25 mM HEPES、3 mM MnCl2、5 mM MgCl2 和 100 μM 正釩酸鈉），并在激酶緩沖液中重新懸浮至 50% (w/v)。將 25 微升珠子懸浮液與適當濃度的化合物和 [γ-32P]ATP（25 μL/孔，200 μCi/mL 激酶緩沖液溶液）一起加入到涂有烯醇化酶的 96 孔高蛋白結合板的每個孔中。在 20°C 下孵育 20 分鐘后，將 60 μL 含有 10 mM ATP 的沸騰 2× 溶解緩沖液添加到測定孔中以終止反應。從孔中取出 30 微升樣品，煮沸 5 分鐘，然后在 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上運行。隨后將凝膠干燥并暴露于柯達 X-AR 膠片。為了定量，使用 Molecular Dynamics 激光掃描儀掃描膠片，并確定主要底物帶烯醇化酶 p46 的光密度。從化合物的密度與濃度圖中確定導致 50% 烯醇化酶磷酸化抑制 (IC50) 的化合物濃度。在測量化合物對抗 Lck 活性的配套實驗中，使用 50 mM EDTA、1 mM ATP 在 Skatron 收集器上對測定板進行兩次清洗循環。然后將閃爍液（100 μL）加入孔中，使用 Pharmacia Biotech 微型 β 計數器測量 P 摻入量。通過繪制酶活性抑制百分比與化合物濃度的關系圖，可確定導致 50% 酶活性抑制的化合物濃度 (IC50)[1]。MCE 尚未獨立證實這些方法的準確性。它們僅供參考。

IC50 & Target：5 nM (Lck), 6 nM (Fyn), 250 nM (EGFR), >50 μM (JAK2)[1]

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參考文獻：

[1]. Hanke JH, et al. Discovery of a novel, potent, and Src family-selective tyrosine kinase inhibitor. Study of Lck- and FynT-dependent T cell activation. J Biol Chem. 1996 Jan 12;271(2):695-701.