編者按：人腸道類器官（HIOs）是腸道器官發育和腸道生理相關研究的有力工具，但是免疫功能的缺失限制了HIOs在研究中更進一步的應用。那么，是否有免疫功能更完善的腸道類器官模型？如何在類器官上實現結構和免疫功能的互作？
今天我們來解讀一項于2023年1月26日發表在《自然·生物技術》的新研究——《In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice》，該研究報道了一種包含人類免疫結構的HIOs，該研究為食物過敏、腸道感染疾病及腸道免疫發育相關研究提供了新模型及新見解。
一、研究背景
腸道是機體免疫系統中的組成部分，腸道的上皮層、固有層、淋巴濾泡等結構和其免疫功能發揮密切相關，這些結構被統稱為腸道相關淋巴組織（GALT）[1]。腸道上皮層和腸道免疫的互作影響腸道發育、自身穩態和胃腸疾病等多個方面，在腸道生理研究中占據重要地位[2]。
多能干細胞來源的人腸道類器官（HIOs）提升了我們對人類腸道發育、生理、疾病等方面的認知[3,4]。但單純的體外類器官模型因缺乏免疫細胞，限制了其在研究中的用途[5]，即便是類器官與免疫細胞共培養的模型也無法很好的重現復雜的人類腸道免疫功能[6,7]。因此，一個能夠模擬人類腸道免疫結構的體外模型顯得尤為關鍵。在本文中，研究人員通過把HIOs移植到免疫系統人源化小鼠的腎包膜中，使HIOs的固有層和上皮層等結構浸潤人的免疫細胞，模擬胎兒腸道淋巴濾泡的發育過程。該模型展示了HIOs上皮層和免疫細胞的體內互作，為后續的腸道免疫相關研究開辟了新的道路。
二、研究結果
1. 人的免疫細胞整合到了移植的HIOs中
原文圖1 利用免疫系統人源化小鼠將免疫細胞整合到HIO中
完成HIOs移植后，作者收集了移植后12、16和20周的樣本，發現HIOs移植到免疫系統人源化和非人源化的小鼠中都能長到相似的尺寸，而且移植周期越長，HIO的大小呈現出的個體差異也越強，這一現象在免疫系統人源化和非人源化的小鼠中都存在，推測可能和HIO腸腔中的黏液逐漸積累，不能排出有關。以上結果說明，人源免疫細胞的存在不會影響移植的HIOs的正常生長。此外，免疫組化結果顯示，人免疫細胞（CD45+）遷移到了HIO的粘膜層，且占據了固有層和上皮層，類似胎兒或者成人腸道中免疫細胞的聚集情況。
2. 鑒定免疫細胞類型和豐度
原文圖 2 HIO和人源化小鼠小腸的免疫細胞特征分析
通過質譜流式細胞技術，能鑒定出12種主要的腸道內免疫細胞類型，并統計了每種免疫細胞在移植后隨時間的豐度變化。此實驗中對照組是人源化小鼠小腸，由于缺乏IL-2受體γ鏈（IL-2Rγ），所以缺少腸道淋巴濾泡和潘氏斑等免疫相關結構，導致T細胞和B細胞數量較少，這點也和實驗結果吻合。HIO組T細胞和B細胞的數量處在一個較高的水平，說明HIO中可能存在類似腸道相關淋巴組織（GALT）的結構，能聚集相當數量的B細胞和T細胞。
3. 在發育的HIO中，免疫細胞聚集成類淋巴濾泡結構
原文圖 3 移植后HIO的免疫聚集物中含有B和T細胞
聚集起的免疫細胞在HIO的體內發育過程中逐漸形成了高度組織化的淋巴濾泡樣的結構。淋巴濾泡是一種由T細胞包圍B細胞而形成高度組織化的免疫功能相關結構。免疫組化結果顯示，體內的HIO中有B細胞、T細胞聚集，并隨著時間的發展，逐漸形成了分層明顯的高度組織化狀態，類似腸道中的淋巴濾泡結構。結合人源化小鼠小腸部位觀察不到類似的免疫細胞聚集情況，說明HIO的體內發育過程也伴隨著淋巴濾泡結構的產生和逐漸成熟。
4. HIO中淋巴濾泡樣結構和人淋巴濾泡結構在發育上的時空相關性
原文圖 4 HIO移植后淋巴樣結構與胎兒腸道淋巴發育的關系
在體的HIO由于缺乏抗原和微生物的暴露，其發育過程本質上類似于人胎兒的腸道發育，作者因此通過免疫組化和HE染色的方法對比了HIO中淋巴濾泡樣結構和胎兒淋巴濾泡結構在發育上的時空相關性。結果顯示，人胎兒的腸道發育中的典型事件：T細胞侵入、T細胞B細胞聚集、聚集體分層、出現粒細胞和漿細胞，在HIO的體內發育過程中都能找到類似的對應結果，并且這些結果在時間上呈現出與胎兒體內一致的先后次序。說明體內的HIO環境中表達了獨特的信號，影響了免疫系統的成熟和淋巴組織的形成。
5. 微生物暴露可誘導移植的HIO中出現M細胞
原文圖 5 移植的HIO經微生物暴露后可誘導M細胞
M細胞散落分布于腸道上皮和淋巴濾泡間，是腸道免疫系統中特化的抗原轉運細胞[2]。以前的研究揭示了上皮細胞和淋巴細胞的互作能有效促進M細胞的分化[8]。對M細胞特異性標志物——糖蛋白2（GP2）的免疫組化結果顯示，在注射大腸桿菌裂解液處理72 h的HIO的上皮細胞表面鑒定出GP2，且覆蓋在免疫細胞之上，符合預期。說明大腸桿菌暴露誘導了M細胞的產生，通過qPCR檢測GP2在注射大腸桿菌裂解液組和注射生理鹽水組的表達水平更進一步支持了這一結論。
M細胞介導的抗原轉運是抗體IgA產生的前提條件[2]，為了證實鑒定到的M細胞具有正?？乖D運功能，并能活化免疫細胞，作者檢測了大腸桿菌裂解液注射過的移植HIO黏膜層的IgA表達水平以及漿細胞的產生情況，結果顯示：雖然在實驗組（注射大腸桿菌裂解液）和對照組（注射生理鹽水）都檢測到了漿細胞的產生，但實驗組的IgA表達水平遠高于對照組。
綜上，腸道菌群暴露促進了移植的HIO上M細胞的產生，并能發揮正常的抗原轉運和活化免疫細胞功能。
三、編者點評
本文構建了一種包含免疫結構的人腸道類器官。不同于免疫共培養的類器官模型，在體內發育的類器官可以展現出自身結構與免疫功能間的互相作用，具有較強的創新性，在腸道發育、腸道功能穩態等方面具有應用價值。但是，該模型構建繁瑣，耗時較長（文中耗時半年），目前不適用于高通量的免疫療法藥物敏感性評價等工作。
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參考資料：
[1] Mowat AM, Agace WW. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 2014 Oct;14(10):667-85.
[2] Rios D, Wood MB, Li J, Chassaing B, Gewirtz AT, Williams IR. Antigen sampling by intestinal M cells is the principal pathway initiating mucosal IgA production to commensal enteric bacteria. Mucosal Immunol. 2016 Jul;9(4):907-16.
[3] Sinagoga KL, Wells JM. Generating human intestinal tissues from pluripotent stem cells to study development and disease. EMBO J. 2015 May 5;34(9):1149-63.
[4] Singh A, Poling HM, Spence JR, Wells JM, Helmrath MA. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2020 Sep 1;319(3):G375-G381.
[5] Noel G, Baetz NW, Staab JF, Donowitz M, Kovbasnjuk O, Pasetti MF, Zachos NC. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 2017 Mar 27;7:45270.
[6] Staab JF, Lemme-Dumit JM, Latanich R, Pasetti MF, Zachos NC. Co-Culture System of Human Enteroids/Colonoids with Innate Immune Cells. Curr Protoc Immunol. 2020 Dec;131(1):e113.
[7] Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Clevers H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 2020 May;20(5):279-293.
[8] Mabbott NA, Donaldson DS, Ohno H, Williams IR, Mahajan A. Microfold (M) cells: important immunosurveillance posts in the intestinal epithelium. Mucosal Immunol. 2013 Jul;6(4):666-77.