題目：A Pliable Mediator Acts as a Functional Rather Than an Architectural Bridge between Promoters and Enhancers
期刊：Cell
影響因子：36.2
主要技術：CRISPR-Cas9，degron，Hi-C，cryo-EM
研究背景
多亞基中介體復合物在真核生物RNA聚合酶II（Pol II）的轉錄調節中起重要作用。中介體通過未知的機制將功能信息從與增強子結合的TF（Transcription factor）傳遞到啟動子的基礎轉錄機制中。中介體各種亞基的突變導致人類基因表達的顯著缺陷和人類疾病。雖然只有一小部分后生動物特異性亞基被報道出對體外轉錄和胚胎發育至關重要，但是它們的保守性表明它們可能有助于增強高等生物體中轉錄調控的復雜性。
研究結果
1、mMED的EM分析
為了研究mMED結構和亞基組織，包括后生動物特異性亞基的位置，作者使用cryo-EM獲得復合物的亞納米分辨率圖。從CH12小鼠B細胞免疫純化mMED，其中通過CRISPR-Cas9在MED19的N末端標記FLAG。對163,184個所選圖像對準參數的最終改進（來自20個傾斜顯微照片的20％），得到總分辨率為5.9A°的mMED低溫-EM圖（圖1A）。作者證實除較大的MED14 C末端外，核心mMED亞基的相對排列與酵母核心中介體有顯著的相似性（圖 1B）?；谂cSp Mediator的同源性，作者通過確定mMED中的頭部，中部和MED14的邊界，確定了哺乳動物結構中的所有非核心密度（圖1C）。在mMED中，MED14 C末端參與尾部錨定，但核-尾界面相當廣泛和復雜，其中包括尾部與頭部、中部之間的額外接觸（圖1C）。
Figure 1. mMED Cryo-EM Map and Module Organization
2、哺乳動物尾部模塊的布置和結構
mMED尾部分為兩個連接的段。較小的一個（基于其在低溫EM圖中的體積165 kDa）與頭部鉗口鄰接并且圍繞MED14 C末端包裹。第二個較大的尾段（380 kDa）對應于Sc尾模塊（圖1C）。作者將亞基缺失和標記與EM成像相結合，以揭示特定尾部亞基的位置。觀察哺乳動物和酵母尾部之間的結構同源性以及MED23-MED24-MED16尾部子模塊表明，較大尾部的中間部分的密度與MED16相對應。3D差異分析顯示MED25占據大尾段的中心位置，其楔入MED16，MED23和MED24 N末端的交叉點。這與人類中介體中尾部亞基相互作用的生化分析一致，證實了MED25與MED16，MED23和MED24之間廣泛的相互作用。
與yMED相比，后生動物特異性亞基的存在導致尾核界面更加擴展，涉及更多的模塊間接觸并導致穩定的構象。尾部是TF的主要目標，其增加的復雜性可能為高等真核生物中更復雜的轉錄調節提供機會（圖2）。
Figure 2. mMED Tail Structure, Subunit Orga nization, and Core Interactions
3、mMED基因分析
為了研究mMED結構的功能意義，作者對小鼠細胞中的中介體進行了全面的遺傳分析。作者使用CRISPR-Cas9，以T細胞（原代和EL4），B細胞（CH12）和胚胎干細胞（ESC）中的33個亞基為靶向，分析了總共16,399個靶向克隆。值得注意的是，B，T和ESC之間的遺傳篩選率為88％（33個中的29個）（圖3A）。總的來說，其中15個亞基對所有細胞類型的生存能力至關重要，而另外14個亞基可以是純合缺失的（圖3A）。
在真核生物中，大多數mMED核心亞基的基本性質是一致的，就是保護核心Mediator和PIC結構。同時，作者的結果暗示哺乳動物細胞的體內轉錄和整體生存力要求酵母或最小核中無中介體亞基。
Figure 3. mMED Genetic and Functional Analysis
4、mMED核心亞基的功能分析
作者應用轉錄組測試不屬于尾部的非必需亞基在體內作用，發現每次敲除中僅有相對少量的基因受影響（圖3B）。為了確定由mMED調節的全部基因，作者將MED14主鏈與自我切除的丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶 - degron（SMASh [小分子輔助關閉]）融合（圖3C）。研究結果支持中介體穩定PIC并促進CTD磷酸化的觀點。因此，與調節一部分基因表達的非必需中介體亞基相反，完整復合物是哺乳動物細胞中全局Pol II募集和轉錄組擴增所必需的。相反，至少在短期內，表觀遺傳可及性不需要中介體（圖3E）。
5、mMED尾部模塊的功能分析
mED14-degron的一個限制是它無法區分中介體在啟動子激活Pol II的作用與其作為增強子結合TF的?？课稽c的作用。當尾部不存在時，Pol II活性在整個基因組中受到輕微影響，單敲除沒有顯示出這種表型。受影響基因的啟動子平均與10個H3K27Ac + H3K4me1 +增強子相關，而未受影響的基因的啟動子為6個（p <2.2e16）（圖4C）。這支持了mMED尾部在TF和Pol II之間創建功能橋梁的概念。
Figure 4. Tailless Mutant and Effect of MED1 and Tail Subunit Deletions on mMED Interaction with Pol II and CKM
6、中介體-POL II和中介體-CKM相互作用的尾部調節
該領域的一個關鍵問題是中介體如何促進Pol II的TF激活，首先，尾部突變體的Cryo-EM分析發現MED15，MED16，MED24或MED23-MED24-MED25的缺失使尾部模塊或其與核心的相互作用不穩定（圖4D），這是由于缺乏相應的尾部亞基，而不是由于移動性增加而未能檢測到它們的密度。TF和尾部亞基之間的相互作用可能影響尾部結構，因此影響其與核心的相互作用。其次，尾部完整性或與核心相互作用的缺失會對中介體的相互作用產生巨大影響。后生動物特異性亞基可能通過對介體結構和構象的進一步影響而影響介體相互作用。
7、中介體在啟動子-增強子相互作用中的作用
在穩定染色質環的情況下TF與中介體的尾部接觸，啟動子與同源增強子（P-E）相連接。為了直接評估P-E接觸是否需要中介體，作者在幾乎無mMED的B細胞中原位進行Hi-C。作者認為，P-E的相互作用持續存在于中介體和Pol II急劇耗盡的哺乳動物細胞中。為了評估中介體-Pol II或黏連蛋白對P-E接觸的貢獻，應用啟動子捕獲Hi-C（PCHi-C）。研究表明即使沒有CTCF環，中介體和Pol II對 PP或PE的相互作用也沒有明顯的貢獻，中介體和Pol II都不需要橋連接來調節DNA（圖5和圖6）。
Figure 5. P-E Interactions Are Largely Imper[1] vious to Acute Removal of Mediator and Pol II but Dependent on Cohesin
Figure 6. Analysis of Mediator-Pol II Degron
8、MED突變細胞的長期結構變化
作者認為中介體和Pol II可能是通過使環狀結構域變得可接近結構蛋白質，間接影響染色質拓撲結構。作者檢測無尾部細胞，發現P-E接觸在受影響的基因座的轉錄上升或下降后增加或減少（圖7A）。相比之下，當黏連蛋白耗盡時，P-E接觸減少50％（圖7A）。在少數情況下，整個環結構域丟失或獲得（圖7B和7C），表明無尾細胞的拓撲表型是間接的。中介體尾部缺失對染色質相互作用的影響可能是由于細胞增殖時結構蛋白募集的下游變化，DNA甲基化和可能的其他表觀遺傳標記起著可及性作用。因此，雖然中介體和Pol II在啟動子和增強子之間建立了一個功能橋梁，但它們在3D中的接近度并不是絕對必需的。
Figure 7. The Impact of Mediator Tail Deletion on Promoter-Enhancer Interactions
總結
雖然中介體在真核轉錄中起關鍵作用，但對其作用機制知之甚少。該研究結合了CRISPR-Cas9基因篩選，degron，Hi-C和低溫電子顯微鏡（cryo-EM）來剖析哺乳動物中介體（mMED）的功能和結構。 B細胞、T細胞和胚胎干細胞（ESC）中的缺失分析確定了Pol II募集全基因組所需的核心亞基。相反的，喪失非必需亞基主要影響啟動子與多種增強子的連接。與目前的模型相反，束縛調節DNA時mMED和Pol II是不必要的。Cryo-EM分析顯示非必需亞基增加了尾部模塊的結構復雜性，尾部模塊是主要的轉錄因子靶標。尾部結構的變化顯著增加Pol II和激酶模塊的相互作用。作者提出中介體的結構柔韌性使其能夠整合和傳遞調控信號，在啟動子和增強子之間充當功能者而非橋梁。