題目：A Pliable Mediator Acts as a Functional Rather Than an Architectural Bridge between Promoters and Enhancers
期刊：Cell
影響因子：36.2
主要技術(shù)：CRISPR-Cas9，degron，Hi-C，cryo-EM
研究背景
多亞基中介體復(fù)合物在真核生物RNA聚合酶II（Pol II）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用。中介體通過未知的機制將功能信息從與增強子結(jié)合的TF（Transcription factor）傳遞到啟動子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機制中。中介體各種亞基的突變導(dǎo)致人類基因表達的顯著缺陷和人類疾病。雖然只有一小部分后生動物特異性亞基被報道出對體外轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育至關(guān)重要，但是它們的保守性表明它們可能有助于增強高等生物體中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性。
研究結(jié)果
1、mMED的EM分析
為了研究mMED結(jié)構(gòu)和亞基組織，包括后生動物特異性亞基的位置，作者使用cryo-EM獲得復(fù)合物的亞納米分辨率圖。從CH12小鼠B細胞免疫純化mMED，其中通過CRISPR-Cas9在MED19的N末端標(biāo)記FLAG。對163,184個所選圖像對準(zhǔn)參數(shù)的最終改進（來自20個傾斜顯微照片的20％），得到總分辨率為5.9A°的mMED低溫-EM圖（圖1A）。作者證實除較大的MED14 C末端外，核心mMED亞基的相對排列與酵母核心中介體有顯著的相似性（圖 1B）。基于與Sp Mediator的同源性，作者通過確定mMED中的頭部，中部和MED14的邊界，確定了哺乳動物結(jié)構(gòu)中的所有非核心密度（圖1C）。在mMED中，MED14 C末端參與尾部錨定，但核-尾界面相當(dāng)廣泛和復(fù)雜，其中包括尾部與頭部、中部之間的額外接觸（圖1C）。
Figure 1. mMED Cryo-EM Map and Module Organization
2、哺乳動物尾部模塊的布置和結(jié)構(gòu)
mMED尾部分為兩個連接的段。較小的一個（基于其在低溫EM圖中的體積165 kDa）與頭部鉗口鄰接并且圍繞MED14 C末端包裹。第二個較大的尾段（380 kDa）對應(yīng)于Sc尾模塊（圖1C）。作者將亞基缺失和標(biāo)記與EM成像相結(jié)合，以揭示特定尾部亞基的位置。觀察哺乳動物和酵母尾部之間的結(jié)構(gòu)同源性以及MED23-MED24-MED16尾部子模塊表明，較大尾部的中間部分的密度與MED16相對應(yīng)。3D差異分析顯示MED25占據(jù)大尾段的中心位置，其楔入MED16，MED23和MED24 N末端的交叉點。這與人類中介體中尾部亞基相互作用的生化分析一致，證實了MED25與MED16，MED23和MED24之間廣泛的相互作用。
與yMED相比，后生動物特異性亞基的存在導(dǎo)致尾核界面更加擴展，涉及更多的模塊間接觸并導(dǎo)致穩(wěn)定的構(gòu)象。尾部是TF的主要目標(biāo)，其增加的復(fù)雜性可能為高等真核生物中更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)提供機會（圖2）。
Figure 2. mMED Tail Structure, Subunit Orga nization, and Core Interactions
3、mMED基因分析
為了研究mMED結(jié)構(gòu)的功能意義，作者對小鼠細胞中的中介體進行了全面的遺傳分析。作者使用CRISPR-Cas9，以T細胞（原代和EL4），B細胞（CH12）和胚胎干細胞（ESC）中的33個亞基為靶向，分析了總共16,399個靶向克隆。值得注意的是，B，T和ESC之間的遺傳篩選率為88％（33個中的29個）（圖3A）。總的來說，其中15個亞基對所有細胞類型的生存能力至關(guān)重要，而另外14個亞基可以是純合缺失的（圖3A）。
在真核生物中，大多數(shù)mMED核心亞基的基本性質(zhì)是一致的，就是保護核心Mediator和PIC結(jié)構(gòu)。同時，作者的結(jié)果暗示哺乳動物細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和整體生存力要求酵母或最小核中無中介體亞基。
Figure 3. mMED Genetic and Functional Analysis
4、mMED核心亞基的功能分析
作者應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測試不屬于尾部的非必需亞基在體內(nèi)作用，發(fā)現(xiàn)每次敲除中僅有相對少量的基因受影響（圖3B）。為了確定由mMED調(diào)節(jié)的全部基因，作者將MED14主鏈與自我切除的丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶 - degron（SMASh [小分子輔助關(guān)閉]）融合（圖3C）。研究結(jié)果支持中介體穩(wěn)定PIC并促進CTD磷酸化的觀點。因此，與調(diào)節(jié)一部分基因表達的非必需中介體亞基相反，完整復(fù)合物是哺乳動物細胞中全局Pol II募集和轉(zhuǎn)錄組擴增所必需的。相反，至少在短期內(nèi)，表觀遺傳可及性不需要中介體（圖3E）。
5、mMED尾部模塊的功能分析
mED14-degron的一個限制是它無法區(qū)分中介體在啟動子激活Pol II的作用與其作為增強子結(jié)合TF的停靠位點的作用。當(dāng)尾部不存在時，Pol II活性在整個基因組中受到輕微影響，單敲除沒有顯示出這種表型。受影響基因的啟動子平均與10個H3K27Ac + H3K4me1 +增強子相關(guān)，而未受影響的基因的啟動子為6個（p <2.2e16）（圖4C）。這支持了mMED尾部在TF和Pol II之間創(chuàng)建功能橋梁的概念。
Figure 4. Tailless Mutant and Effect of MED1 and Tail Subunit Deletions on mMED Interaction with Pol II and CKM
6、中介體-POL II和中介體-CKM相互作用的尾部調(diào)節(jié)
該領(lǐng)域的一個關(guān)鍵問題是中介體如何促進Pol II的TF激活，首先，尾部突變體的Cryo-EM分析發(fā)現(xiàn)MED15，MED16，MED24或MED23-MED24-MED25的缺失使尾部模塊或其與核心的相互作用不穩(wěn)定（圖4D），這是由于缺乏相應(yīng)的尾部亞基，而不是由于移動性增加而未能檢測到它們的密度。TF和尾部亞基之間的相互作用可能影響尾部結(jié)構(gòu)，因此影響其與核心的相互作用。其次，尾部完整性或與核心相互作用的缺失會對中介體的相互作用產(chǎn)生巨大影響。后生動物特異性亞基可能通過對介體結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的進一步影響而影響介體相互作用。
7、中介體在啟動子-增強子相互作用中的作用
在穩(wěn)定染色質(zhì)環(huán)的情況下TF與中介體的尾部接觸，啟動子與同源增強子（P-E）相連接。為了直接評估P-E接觸是否需要中介體，作者在幾乎無mMED的B細胞中原位進行Hi-C。作者認(rèn)為，P-E的相互作用持續(xù)存在于中介體和Pol II急劇耗盡的哺乳動物細胞中。為了評估中介體-Pol II或黏連蛋白對P-E接觸的貢獻，應(yīng)用啟動子捕獲Hi-C（PCHi-C）。研究表明即使沒有CTCF環(huán)，中介體和Pol II對 PP或PE的相互作用也沒有明顯的貢獻，中介體和Pol II都不需要橋連接來調(diào)節(jié)DNA（圖5和圖6）。
Figure 5. P-E Interactions Are Largely Imper[1] vious to Acute Removal of Mediator and Pol II but Dependent on Cohesin
Figure 6. Analysis of Mediator-Pol II Degron
8、MED突變細胞的長期結(jié)構(gòu)變化
作者認(rèn)為中介體和Pol II可能是通過使環(huán)狀結(jié)構(gòu)域變得可接近結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，間接影響染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。作者檢測無尾部細胞，發(fā)現(xiàn)P-E接觸在受影響的基因座的轉(zhuǎn)錄上升或下降后增加或減少（圖7A）。相比之下，當(dāng)黏連蛋白耗盡時，P-E接觸減少50％（圖7A）。在少數(shù)情況下，整個環(huán)結(jié)構(gòu)域丟失或獲得（圖7B和7C），表明無尾細胞的拓?fù)浔硇褪情g接的。中介體尾部缺失對染色質(zhì)相互作用的影響可能是由于細胞增殖時結(jié)構(gòu)蛋白募集的下游變化，DNA甲基化和可能的其他表觀遺傳標(biāo)記起著可及性作用。因此，雖然中介體和Pol II在啟動子和增強子之間建立了一個功能橋梁，但它們在3D中的接近度并不是絕對必需的。
Figure 7. The Impact of Mediator Tail Deletion on Promoter-Enhancer Interactions
總結(jié)
雖然中介體在真核轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，但對其作用機制知之甚少。該研究結(jié)合了CRISPR-Cas9基因篩選，degron，Hi-C和低溫電子顯微鏡（cryo-EM）來剖析哺乳動物中介體（mMED）的功能和結(jié)構(gòu)。 B細胞、T細胞和胚胎干細胞（ESC）中的缺失分析確定了Pol II募集全基因組所需的核心亞基。相反的，喪失非必需亞基主要影響啟動子與多種增強子的連接。與目前的模型相反，束縛調(diào)節(jié)DNA時mMED和Pol II是不必要的。Cryo-EM分析顯示非必需亞基增加了尾部模塊的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，尾部模塊是主要的轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)。尾部結(jié)構(gòu)的變化顯著增加Pol II和激酶模塊的相互作用。作者提出中介體的結(jié)構(gòu)柔韌性使其能夠整合和傳遞調(diào)控信號，在啟動子和增強子之間充當(dāng)功能者而非橋梁。