許多新冠患者會出現COVID-19相關的急性后遺癥（post-acute sequelae of COVID-19，PASC），常見的如記憶喪失、胃腸痛、疲勞、嗅覺喪失、呼吸障礙等，甚至出現哮*、心血管疾病等嚴重病癥。近兩年，新冠后遺癥越來越受到關注，然而相關聯的免疫系統的變化仍不清楚。

研究對象

209例新冠后遺癥患者，457名健康對照

技術路線

步驟1：描繪新冠后遺癥研究隊列的基本情況

步驟2：分析自身抗體和新冠特異性抗體與后遺癥的關聯

步驟3：利用單細胞TCR測序分析后遺癥患者T細胞分群特征

步驟4：進一步分析患者的新冠特異性T細胞在單細胞水平特征

步驟5：單細胞測序揭示出新冠后遺癥患者的四種免疫應答類型

研究結果

1. 新冠相關后遺癥統計學特征及蛋白組和代謝組標志物

作者利用兩個隊列研究新冠后遺癥（Post-acute sequelae of COVID-19，PASC）。INCOV隊列入組了209名新冠后遺癥患者和457名健康對照，患者在新冠確診（T1期）、急性期（T2期）、發病后2-3個月恢復期（T3期）記錄臨床特征并取樣分析。另有HAARVI隊列作為驗證人群。主要后遺癥類型有呼吸疾?。?span lang="EN-US">42%）、神經疾?。?span lang="EN-US">25%）、嗅覺/味覺喪失（18%）、胃腸道疾?。?span lang="EN-US">9%）等。新冠還可能導致先前潛伏的病毒再度激活。

通過進一步分析，發現新冠后遺癥的發生與患者的性別（sex）、年齡、疾病嚴重程度以及是否伴有自身免疫相關的疾病等密切相關。研究者通過對血漿的蛋白組和代謝組分析，找到了新冠后遺癥相關的生物標志物。皮質醇和皮質酮水平降低的患者易出現呼吸道相關后遺癥，負調控晝夜節律和睡眠周期相關蛋白升高易出現神經系統癥狀。

圖1 新冠后遺癥研究隊列情況

2. 自身抗體和新冠特異抗體與新冠后遺癥的關聯

先前報道顯示自身抗體異常是新冠死亡和后遺癥的風險因素，因此本文分析了新冠后遺癥患者體內6種自身抗體和9種新冠病毒特異抗體的滴度變化。結果顯示，后遺癥患者自身抗體的檢出率在T1期和T3期分別達到56%和44%，而這些人群在患新冠前僅有6%有自身免疫問題，表明兩者間存在一定的關聯。此外，神經相關后遺癥的抗核殼蛋白IgG更高，胃腸道后遺癥、**和多痰患者病情與抗IFN-α2等自身抗體正相關，這些抗體的早期滴度特征可作為預測新冠后遺癥特定的生物標志物。

通過進一步分析顯示，9種新冠特異抗體滴度相互間呈正相關，但新冠抗體與抗IFN-α2等6種自身抗體有不同程度的負相關，這種負相關可能推動了后遺癥患者的免疫和炎癥反應?？?span lang="EN-US">IFN-α2自身抗體可通過中和IFN-α2信號，使得依賴IFN的B細胞反應失調，限制病毒特異性抗體的產生；對IFN-α2信號的抑制還會促進IFN-γ、CRP、IL-6等促炎因子上調，使得自身抗體陽性的患者表現出更高水平的炎癥反應。

圖2 不同抗體的滴度變化與新冠后遺癥的關聯

3.利用單細胞TCR測序分析T細胞分群及動態變化

T細胞受體（TCR）基因的特異性和多樣性可以反映出免疫系統的應答變化，因此本文利用單細胞TCR測序，分析了患者CD8⁺和CD4⁺ T細胞的動態演變。單細胞TCR測序將CD8⁺和CD4⁺ T細胞均分成了5個亞群，不同亞群豐度在T2期、T3期變化巨大，例如CD8⁺ T細胞亞群1和亞群2均有細胞毒性T_EMRA細胞樣特征，但亞群1在T2期占主導，亞群2在T3期占主導。從細胞亞群的基因表達特征來看，效應型記憶T細胞前體細胞亞群中，上調表達的基因參與了抑制炎癥和防止T細胞過度激活，這種特異性表達會影響細胞亞群演變及后遺癥的形成。此外，研究者注意到胃腸道后遺癥的患者，其CD4⁺第4亞群（細胞毒性T細胞）在T3期富集，該亞群與后遺癥同樣存在關聯。

圖3 單細胞測序顯示的T細胞亞群變化及基因表達變化

4. 不同后遺癥患者的SARS-CoV-2特異性T細胞存在演化差異

研究者進一步分析了特異性識別新冠病毒的T細胞的基因表達情況。首先通過MIRA技術（TCR抗原特異性多重鑒定）找到新冠抗原表位，再利用CITE-seq技術標記識別對新冠病毒親和的CD8⁺T細胞，并在單細胞水平分析這些細胞的特征。結果表明，胃腸道后遺癥病人的新冠特異CD8⁺T細胞在T2急性期呈現未分化狀態，而在T3期則表現出更多的細胞毒性T細胞特征。相比之下，有呼吸道后遺癥的患者，其新冠特異性T細胞的變化則是相反的趨勢。以上結果表明胃腸道和呼吸系統后遺癥的病因可能不同。

圖4 sc-CITE-seq單細胞測序顯示新冠特異性T細胞的特征

5.免疫細胞單細胞轉錄組揭示了新冠后遺癥患者的四種免疫應答類型

綜合以上對免疫細胞在單細胞水平的分析結果，研究者將新冠后遺癥患者的免疫應答類型分為4組。第一組，CD4⁺T細胞具有Th₁樣免疫反應特征，巨噬細胞具有M1極化的促炎特征，CD8⁺T細胞和NK細胞具有細胞毒性特征，B細胞具有記憶細胞特征。第二組的特征則相差較大，CD4⁺T細胞為Th₂樣特征，巨噬細胞為M2極化的抗炎特征。第三組為中間型，其免疫細胞變化特征介于第一組和第二組之間。第四組（naive組）表現出Naive T細胞和B細胞狀態，NK細胞處于靜息狀態。其中，第二組的住院率更高，提示其免疫狀態可能不利于清除新冠病毒。

圖5 PASC后遺癥患者的4種免疫應答類型

小編小結

目前，關于新冠的后遺癥受到了極大的關注，但引起新冠后遺癥的因素，尤其是免疫學方面的認知，仍存在較大的空白。本研究針對209例新冠后遺癥患者較為系統地分析了患者免疫相關變化。通過通過單細胞多組學聯合，系統展示了免疫細胞在確診初期、急性期和恢復期的細胞亞群變化和對應的基因表達變化，并發現了不同亞群細胞與對應后遺癥的聯系，最后揭示了新冠后遺癥患者的四種免疫應答類型。本研究為新冠后遺癥的早期診斷和預測指出了新的方向，為研究新冠后遺癥的形成機制提供了關鍵線索。