許多新冠患者會(huì)出現(xiàn)COVID-19相關(guān)的急性后遺癥（post-acute sequelae of
COVID-19，PASC），常見(jiàn)的如記憶喪失、胃腸痛、疲勞、嗅覺(jué)喪失、呼吸障礙等，甚至出現(xiàn)哮*、心血管疾病等嚴(yán)重病癥。近兩年，新冠后遺癥越來(lái)越受到關(guān)注，然而相關(guān)聯(lián)的免疫系統(tǒng)的變化仍不清楚。
209例新冠后遺癥患者，457名健康對(duì)照
技術(shù)路線
步驟1：描繪新冠后遺癥研究隊(duì)列的基本情況
步驟2：分析自身抗體和新冠特異性抗體與后遺癥的關(guān)聯(lián)
步驟3：利用單細(xì)胞TCR測(cè)序分析后遺癥患者T細(xì)胞分群特征
步驟4：進(jìn)一步分析患者的新冠特異性T細(xì)胞在單細(xì)胞水平特征
步驟5：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序揭示出新冠后遺癥患者的四種免疫應(yīng)答類型
研究結(jié)果
1. 新冠相關(guān)后遺癥統(tǒng)計(jì)學(xué)特征及蛋白組和代謝組標(biāo)志物
作者利用兩個(gè)隊(duì)列研究新冠后遺癥（Post-acute sequelae of COVID-19，PASC）。INCOV隊(duì)列入組了209名新冠后遺癥患者和457名健康對(duì)照，患者在新冠確診（T1期）、急性期（T2期）、發(fā)病后2-3個(gè)月恢復(fù)期（T3期）記錄臨床特征并取樣分析。另有HAARVI隊(duì)列作為驗(yàn)證人群。主要后遺癥類型有呼吸疾病（42%）、神經(jīng)疾病（25%）、嗅覺(jué)/味覺(jué)喪失（18%）、胃腸道疾病（9%）等。新冠還可能導(dǎo)致先前潛伏的病毒再度激活。
通過(guò)進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)新冠后遺癥的發(fā)生與患者的性別（sex）、年齡、疾病嚴(yán)重程度以及是否伴有自身免疫相關(guān)的疾病等密切相關(guān)。研究者通過(guò)對(duì)血漿的蛋白組和代謝組分析，找到了新冠后遺癥相關(guān)的生物標(biāo)志物。皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮水平降低的患者易出現(xiàn)呼吸道相關(guān)后遺癥，負(fù)調(diào)控晝夜節(jié)律和睡眠周期相關(guān)蛋白升高易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。
圖1 新冠后遺癥研究隊(duì)列情況
2. 自身抗體和新冠特異抗體與新冠后遺癥的關(guān)聯(lián)
先前報(bào)道顯示自身抗體異常是新冠死亡和后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)因素，因此本文分析了新冠后遺癥患者體內(nèi)6種自身抗體和9種新冠病毒特異抗體的滴度變化。結(jié)果顯示，后遺癥患者自身抗體的檢出率在T1期和T3期分別達(dá)到56%和44%，而這些人群在患新冠前僅有6%有自身免疫問(wèn)題，表明兩者間存在一定的關(guān)聯(lián)。此外，神經(jīng)相關(guān)后遺癥的抗核殼蛋白IgG更高，胃腸道后遺癥、**和多痰患者病情與抗IFN-α2等自身抗體正相關(guān)，這些抗體的早期滴度特征可作為預(yù)測(cè)新冠后遺癥特定的生物標(biāo)志物。
通過(guò)進(jìn)一步分析顯示，9種新冠特異抗體滴度相互間呈正相關(guān)，但新冠抗體與抗IFN-α2等6種自身抗體有不同程度的負(fù)相關(guān)，這種負(fù)相關(guān)可能推動(dòng)了后遺癥患者的免疫和炎癥反應(yīng)。抗IFN-α2自身抗體可通過(guò)中和IFN-α2信號(hào)，使得依賴IFN的B細(xì)胞反應(yīng)失調(diào)，限制病毒特異性抗體的產(chǎn)生；對(duì)IFN-α2信號(hào)的抑制還會(huì)促進(jìn)IFN-γ、CRP、IL-6等促炎因子上調(diào)，使得自身抗體陽(yáng)性的患者表現(xiàn)出更高水平的炎癥反應(yīng)。
圖2 不同抗體的滴度變化與新冠后遺癥的關(guān)聯(lián)
3.利用單細(xì)胞TCR測(cè)序分析T細(xì)胞分群及動(dòng)態(tài)變化
T細(xì)胞受體（TCR）基因的特異性和多樣性可以反映出免疫系統(tǒng)的應(yīng)答變化，因此本文利用單細(xì)胞TCR測(cè)序，分析了患者CD8+和CD4+ T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)演變。單細(xì)胞TCR測(cè)序?qū)?/span>CD8+和CD4+ T細(xì)胞均分成了5個(gè)亞群，不同亞群豐度在T2期、T3期變化巨大，例如CD8+ T細(xì)胞亞群1和亞群2均有細(xì)胞毒性TEMRA細(xì)胞樣特征，但亞群1在T2期占主導(dǎo)，亞群2在T3期占主導(dǎo)。從細(xì)胞亞群的基因表達(dá)特征來(lái)看，效應(yīng)型記憶T細(xì)胞前體細(xì)胞亞群中，上調(diào)表達(dá)的基因參與了抑制炎癥和防止T細(xì)胞過(guò)度激活，這種特異性表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞亞群演變及后遺癥的形成。此外，研究者注意到胃腸道后遺癥的患者，其CD4+第4亞群（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）在T3期富集，該亞群與后遺癥同樣存在關(guān)聯(lián)。
圖3 單細(xì)胞測(cè)序顯示的T細(xì)胞亞群變化及基因表達(dá)變化
4. 不同后遺癥患者的SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞存在演化差異
研究者進(jìn)一步分析了特異性識(shí)別新冠病毒的T細(xì)胞的基因表達(dá)情況。首先通過(guò)MIRA技術(shù)（TCR抗原特異性多重鑒定）找到新冠抗原表位，再利用CITE-seq技術(shù)標(biāo)記識(shí)別對(duì)新冠病毒親和的CD8+T細(xì)胞，并在單細(xì)胞水平分析這些細(xì)胞的特征。結(jié)果表明，胃腸道后遺癥病人的新冠特異CD8+T細(xì)胞在T2急性期呈現(xiàn)未分化狀態(tài)，而在T3期則表現(xiàn)出更多的細(xì)胞毒性T細(xì)胞特征。相比之下，有呼吸道后遺癥的患者，其新冠特異性T細(xì)胞的變化則是相反的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明胃腸道和呼吸系統(tǒng)后遺癥的病因可能不同。
圖4 sc-CITE-seq單細(xì)胞測(cè)序顯示新冠特異性T細(xì)胞的特征
5.免疫細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示了新冠后遺癥患者的四種免疫應(yīng)答類型
綜合以上對(duì)免疫細(xì)胞在單細(xì)胞水平的分析結(jié)果，研究者將新冠后遺癥患者的免疫應(yīng)答類型分為4組。第一組，CD4+T細(xì)胞具有Th1樣免疫反應(yīng)特征，巨噬細(xì)胞具有M1極化的促炎特征，CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞具有細(xì)胞毒性特征，B細(xì)胞具有記憶細(xì)胞特征。第二組的特征則相差較大，CD4+T細(xì)胞為Th2樣特征，巨噬細(xì)胞為M2極化的抗炎特征。第三組為中間型，其免疫細(xì)胞變化特征介于第一組和第二組之間。第四組（naive組）表現(xiàn)出Naive T細(xì)胞和B細(xì)胞狀態(tài)，NK細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。其中，第二組的住院率更高，提示其免疫狀態(tài)可能不利于清除新冠病毒。
圖5 PASC后遺癥患者的4種免疫應(yīng)答類型
小編小結(jié)
目前，關(guān)于新冠的后遺癥受到了極大的關(guān)注，但引起新冠后遺癥的因素，尤其是免疫學(xué)方面的認(rèn)知，仍存在較大的空白。本研究針對(duì)209例新冠后遺癥患者較為系統(tǒng)地分析了患者免疫相關(guān)變化。通過(guò)通過(guò)單細(xì)胞多組學(xué)聯(lián)合，系統(tǒng)展示了免疫細(xì)胞在確診初期、急性期和恢復(fù)期的細(xì)胞亞群變化和對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)變化，并發(fā)現(xiàn)了不同亞群細(xì)胞與對(duì)應(yīng)后遺癥的聯(lián)系，最后揭示了新冠后遺癥患者的四種免疫應(yīng)答類型。本研究為新冠后遺癥的早期診斷和預(yù)測(cè)指出了新的方向，為研究新冠后遺癥的形成機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。