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IHC 實驗常見問題
1、染色過強
原因：抗體濃度過高或孵育時間過長
解決辦法：降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1 小時或4 度過夜
原因：孵育溫度過高超過37 度
解決辦法：一般在室溫20-28 度
原因：DAB 顯色時間過長或濃度過高
解決辦法：顯色時間不超過5-12 分鐘，以顯微鏡下觀察為準
2、非特異性背景染色
原因：操作過程中沖洗不充分
解決辦法：每步沖洗3 次每次5 分鐘
原因：組織中含過氧化物酶未阻斷
解決辦法：可再配置新鮮3%H2O2 封閉孵育時間延長
原因：組織中含內原性生物素
解決辦法：正常非免疫動物血清再封閉
原因：血清蛋白封閉不充分
3、染色弱
原因：抗體濃度過低、孵育時間過短
解決辦法：提高抗體濃度、孵育時間不能少于60 分鐘
原因：操作中添加試劑時緩沖液未瀝干
解決辦法：每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋 （應防止切片干燥）
原因：室溫太低，低于15 度
解決辦法：要改放在37 度孵育箱孵育30-60 分鐘或4 度冰箱過夜
原因：蛋白封閉過度
解決辦法：封閉不要超過12 分鐘
4、染色陰性
原因：操作步驟錯誤
解決辦法：應重試，設陽性對照
原因：組織中無抗原
解決辦法：設陽性對照以驗證試驗結果
原因：一抗與二抗種屬連接錯誤
解決辦法：仔細確定一抗二抗種屬無誤