2022年10月3日廣州醫科大學附屬腫瘤醫院尤強教授團隊在國際期刊Theranostics 上發表了題為《Chitinase-3 like-protein-1 promotes glioma progression via the NF-κB signaling pathway and tumor microenvironment reprogramming》的文章。本文揭示了細胞核 CHI3L1 通過持續激活 NF-κB 信號通路促進腫瘤細胞增殖和存活。相比之下，CHI3L1 結合 CD44 激活 AKT 通路，促進 M2 巨噬細胞在分泌到 TME 后極化，TME 負責促腫瘤環境重編程。總之，該研究結果為 CHI3L1 作為神經膠質瘤治療靶點的潛在作用提供了基礎。
研究背景
膠質瘤是原發性中樞神經系統(CNS)腫瘤的一種異質性組，占所有腦腫瘤的80%。盡管有許多積極的聯合治療，包括手術、化療和放療，但5年總生存率(OS)仍然很低。因此，明確膠質瘤發生發展的關鍵分子和特異性機制將有助于準確診斷和治療。
核因子NF-κB是一個轉錄因子家族，參與病毒感染、免疫應答、細胞增殖和存活以及腫瘤發生。腫瘤細胞內NF-κB通路的激活與腫瘤的發病機制和化療耐藥性有關，抑制NF-κB已被認為是抑制膠質瘤細胞增殖和存活的一種有吸引力的治療方法。然而，腦膠質瘤細胞中負責NF-κB激活的關鍵調節因子仍然未知，需要進一步研究。
除了實質細胞外，腫瘤微環境(TME)中的免疫細胞也經歷了大量的重編程，從而獲得促腫瘤的表型，以促進腫瘤的進展。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是腫瘤相關巨噬細胞中的大多數免疫細胞，促進免疫逃逸和腫瘤進展。膠質瘤中的TAMs包括小膠質細胞或單核細胞來源的群體，而極化的M2 TAMs通過影響干細胞表型轉換、血管生成和細胞因子釋放來促進膠質瘤的生存和生長。TAMs通過C-C基序趨化因子受體2/C-C基序趨化因子配體2(CCL2)途徑抑制、表型轉換和集落刺激因子1受體阻斷而成為惡性膠質瘤的治療靶點。確定M2 TAMs極化的參與者對膠質瘤治療有重要意義。
幾丁質酶3樣蛋白1(CHI3L1)是糖苷水解酶家族18的一員，在氧化損傷、凋亡、焦下垂、細胞外基質調節、Th1/Th2炎癥平衡和實質瘢痕形成等方面起著重要作用。非酶CHI3L1在各種癌癥中高表達，如肺癌、結腸癌、胃癌和乳腺癌，并與癌癥患者的低存活率有關。尤其是上調的CHI3L1和CD44被認為是間充質(MES)膠質瘤的標志物，其主要表現為NF-κB激活。CHI3L1在膠質瘤中如何驅動NF-κB通路激活并參與TME重編程，包括TAMS極化和血管生成等機制有待進一步研究。
本文分析了GEO、腫瘤基因組圖譜(TCGA)和中國膠質瘤基因組圖譜(CGGA)的mRNA-SEQ數據，從mRNA水平探討CHI3L1在膠質瘤中的表達譜。采用免疫組化(IHC)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和Western blot檢測CHI3L1蛋白水平。用Spearman相關分析法探討CHI3L1表達與免疫細胞浸潤的關系。應用單細胞RNA-SEQ數據來表征腫瘤細胞的行為和描繪髓系細胞的景觀。通過4株膠質母細胞瘤(GBM)細胞株和動物實驗，進一步研究了CHI3L1在膠質瘤生存、增殖和侵襲中的作用。
1. CHI3L1在腦膠質瘤中高表達與OS惡化相關
文章分析了TCGA、泛癌和GTEX（共15776例）的mRNA數據，比較了CHI3L1在33種腫瘤和配對正常組織中的表達水平。CHI3L1在癌組織中的表達高于癌旁組織。與其他腫瘤類型相比，GBM是CHI3L1表達最高的腫瘤類型。為了進一步了解CHI3L1表達與膠質瘤表型的關系，作者從GEO、TCGA和CGGA數據庫中提取了具有詳細臨床信息的mRNA微陣列或測序病例。與正常腦膠質瘤患者相比，CHI3L1在腫瘤中過度表達，并且隨著腦膠質瘤級別的增加，CHI3L1的表達水平增加。此外，ELISA檢測膠質瘤患者血清CHI3L1水平高于健康對照組。IHC顯示CHI3L1在分期膠質瘤中富集，特別是在高級別膠質瘤(HGG)(WHOIII-IV)中。Western blot還證實CHI3L1在腫瘤部位比瘤周核心顯著上調，其表達隨著Giloma WHO分級的增加而增加。在TCGA和CGGA中，由于CHI3L1被證明是一種炎癥和腫瘤的生物標志物，作者繪制ROC曲線并計算曲線下面積(AUC)來評價CHI3L1對膠質瘤的診斷價值，一年后的AUC值分別為0.852和0.741。Kaplan-Meier分析顯示，腦膠質瘤患者CHI3L1水平升高與無進展生存率(PFS)和OS發生率降低有關。對于GBM細胞系的基因表達譜，從CCLE網站獲得五個GBM細胞系的數據，以比較CHI3L1的表達。蛋白水平方面，Western blot結果顯示，U87和A172細胞的CHI3L1蛋白水平高于U251和U118細胞?？傊珻HI3L1在腫瘤部位高表達，并與膠質瘤患者的不良生存密切相關。
2. 膠質瘤中CHI3L1的表達與NF-κB通路的激活有關
惡病質信號通路的異常激活有助于神經膠質瘤的進展。因此，作者分析了GEO、TCGA和CGGA隊列，以確定膠質瘤中的激活通路。在GSE100675中，火山圖和熱圖顯示625個上調基因和803個下調基因(logfc=1)。為了進一步分析這一特征，作者進行了基因本體論 (GO) 和基因集富集分析 (GSEA)，分別將細胞周期檢查點和 NF-κB 信號通路確定為最顯著富集的功能術語和通路。熱圖中顯示了正常、腫瘤周圍和腫瘤內組織中 NF-κB 通路的靶基因。在 TCGA 隊列中，作者在神經膠質瘤患者中鑒定了 2546 個上調基因和 1647 個下調基因。CHI3L1 在 TCGA 群組的火山圖和熱圖上被繪制為過度表達的基因。為了更好地表征 CHI3L1 表達與 NF-κB 通路富集之間的關系，作者應用 Hallmark 基因集的基因集變異分析 (GSVA) 來獲得特定通路的定量分析。通過 NF-κB 通路的 TNFɑ 信號在腫瘤部位顯著富集?？傊?，基于轉錄組數據的綜合分析表明，CHI3L1 促進了 NF-κB 通路的激活，在神經膠質瘤的進展過程中充當幫兇。
3. CHI3L1high特異性神經膠質瘤細胞在單細胞水平上主導神經膠質瘤中 NF-κB 通路的激活
作者分析了多區域神經膠質瘤單細胞轉錄組測序數據。從 GEO 數據庫進一步了解細胞調節神經膠質瘤中 NF-κB 通路激活的機制。對總細胞群的UMAP分析確定了 17 個子簇，包括免疫細胞（骨髓和 T 細胞：sc-0、8 、-9 和 -14；分別為 sc-12）、腦細胞（sc-1、-4、-5、-7、-13）、腫瘤細胞（sc-2、-3、-6、-10 , 和 -11), 和小膠質細胞 (sc-15), 而 sc-16 種群太小而無法進行有意義的定義, 主要由它們的譜系身份隔離。細胞亞群的標記基因呈現在小提琴圖中。令人驚訝的是，CHI3L1 優先在神經膠質瘤細胞中表達，其次是中性粒細胞。作者鑒定了兩種不同類型的腫瘤細胞，它們顯示出高水平的神經膠質瘤標志物：CST3、CCT6A、EGFR、MT1X、HOPX、FABP5、CHI3L1、GFAP、SPARCL1、ATP1A2、AQP4、PDGFRA、BCAN 和 SCG3。其中cluster 10被定義為CHI3L1高表達的CHI3L1high腫瘤細胞，其他歸為CHI3L1low組。在 TME 中，與瘤周核相比，中性粒細胞顯著增加，單核細胞急劇減少。為了便于比較，作者將來自正常和腫瘤周圍部位的細胞群合并為一個新組，該組被定義為非腫瘤。作者首先關注 CHI3L1 表達對惡性細胞中 NF-κB 通路激活的作用。GSVA 表明，CHI3L1high 神經膠質瘤細胞通過 NF-κB 通路顯著富集 TNFɑ 信號，而 CHI3L1low 神經膠質瘤細胞表現出抑制的 NF-κB 通路富集。
4. CHI3L1結合ACTN4 和NFKB1，通過促進NF-κB亞基核轉位增強NF-κB 信號通路
HuProt 20K 人類蛋白質組微陣列包含超過 21,000 種親和純化的 GST 標記蛋白，用于鑒定 CHI3L1 結合蛋白，并鑒定了 238 種蛋白質。有趣的是，ACTN1、4、NFKB1、2 和 NFKBIB 被認為是相互結合。此外，作者對腫瘤內和成對的腫瘤周圍組織的冷凍切片進行了 IF 染色，并證實了神經膠質瘤中 CHI3L1 和 NF-κB p65 表達之間的正相關。TNF 是激活轉錄因子 NF-κB 的主要炎癥細胞因子。因此，用 TNFα 處理 U118MG 和 U251MG 細胞長達 4 天，以確定 CHI3L1 表達是否依賴于神經膠質瘤中 NF-κB 通路的持續激活。然后，作者在時間梯度中用低 (50 ng/mL) 和高 (200 ng/mL) 濃度的 TNFα 處理 WT 和 Chi3l1-/- BMDM，從 Chi3l1-/- BMDM中的 5 分鐘起，p65 亞基的磷酸化明顯受到抑制。此外，作者分離了細胞核和細胞質蛋白，以探索 CHI3L1 如何影響 NF-κB p65 亞基的磷酸化和核轉位。蛋白質印跡顯示在用 TNFɑ 處理 0.5 至 4 小時后，Chi3l1-/-BMDMs 中 p65 核轉位明顯減少，而 ACTN4 顯示細胞質和細胞核沒有變化。同樣，用 shCHI3L1 轉染的 U87MG 細胞在 TNFɑ 處理后具有較少的核 p65 和未改變的ACTN4。此外，作者發現CHI3L1在U87MG和A172細胞系中與ACTN4共免疫沉淀。作者進一步證明了 CHI3L1 在 U87MG 細胞的細胞質和細胞核中都與 ACTN4 結合，主要是在細胞核中。此外，雙熒光素酶測定表明，用 CHI3L1 或 ACTN4 轉染可增強 NF-kB 啟動子依賴性熒光素酶活性。此外，與單獨的 ACTN4 相比，CHI3L1和ACTN4的組合顯著增加了熒光素酶活性。此外，作者在 U251 細胞中應用了 dox 誘導型 CHI3L1 表達系統。如圖 4P 所示，dox 誘導的 CHI3L1 表達也增強了 TNFα 對 NF-kB 的激活。Pearson 相關分析表明，在 TCGA 和 CGGA 神經膠質瘤隊列中，CHI3L1 和 ACTN4、NFKB1 或 NFKB2 之間存在強正相關。
5.CHI3L1將TME重編程為膠質瘤中的免疫抑制表型
作者根據 LM22 特征矩陣使用 Cibersort 算法推斷了 TCGA 隊列樣本中 22 種浸潤免疫細胞的絕對水平。作者發現腫瘤中的中性粒細胞和 M2 巨噬細胞顯著增加，而 B 細胞、單核細胞、激活的 NK 細胞和 T 細胞濾泡輔助細胞顯著減少。接下來，將M0、M1和M2巨噬細胞的總和定義為總巨噬細胞，膠質瘤呈現出比正常組織更高的總巨噬細胞浸潤。同樣，作者將 B 和 T 細胞亞群分類為總淋巴細胞，發現正常和膠質瘤部位的總淋巴細胞沒有差異。Spearman相關分析顯示，CHI3L1表達與中性粒細胞和巨噬細胞M2浸潤呈正相關，NK細胞活化與CHI3L1表達呈負相關。此外，作者還基于 TCGA 和 CGGA 數據集探討了 CHI3L1 在調節膠質瘤免疫檢查點表達中的作用。
6. 人腦膠質瘤髓系景觀在單細胞水平上的表達
為了更好地表征神經膠質瘤中骨髓細胞群的特定表型和功能，作者分析了一個公共單細胞 RNA-seq 數據集。作者首先關注單核細胞、小膠質細胞和巨噬細胞軸，最終確定了九個亞群。應用 GSVA 可視化富集通路，上皮間質轉化 (EMT) 和血管生成通路在巨噬細胞中顯著富集。小膠質細胞是中樞神經系統中的一種巨噬細胞，在PI3K Akt mTOR途徑中富集，該途徑是由小膠質細胞介導的免疫抑制靶點。
7. CHI3L1與CD44 相互作用促進TME中的M2巨噬細胞極化
接下來，作者研究了膠質瘤細胞如何將CHI3L1分泌到細胞外空間。用絲狀肌動蛋白(F-actin)、微管、非肌肉肌球蛋白Ⅱ(NMⅡ)、粘著斑激酶(FAK)和細胞骨架張力抑制劑測定所涉及的機械成分。CB預處理24h后，CHI3L1升高，促進F-肌動蛋白向球狀肌動蛋白（G-肌動蛋白）的轉化，降低F-肌動蛋白的含量。U87MG和A172細胞系中ACTN4和P65的表達無差異。CB處理U87MG和A172細胞后，CHI3L1在細胞核和細胞質中的表達均明顯增加。然而，CB治療后CHI3L1的表達水平沒有顯著性差異。因此，F-actin可能參與GBM腫瘤細胞胞外CHI3L1的分泌。TME中的TAMs一般分為兩種表型:M1樣（抗腫瘤、促炎）和M2樣（促腫瘤、抗炎）。冰凍切片發現CHI3L1和CD206的同時高表達與腫瘤分級呈正相關，在GBM組織中不共定位。作者用IL-4、重組人CHI3L1(rhCHI3L1)和U87-MG和A172細胞培養上清液處理THP1。IF分析顯示，rhCHI3L1和培養上清都有助于巨噬細胞從M0表型向M2表型的極化。同時，QPCR結果顯示，巨噬細胞M2標記物(IL-10、CD163、MRC1、ARG1和RetNLB)在IL-4、RhCHI3L1及U87-MG和A172細胞培養上清后mRNA表達明顯增加，而M1標記物(HLA-DR、IL-1β、CD68、CD80、NOS2和MCP-1)無差異或略有改變。
8. CHI3L1對膠質瘤細胞增殖、遷移和存活的調節作用
接下來，作者發現 CHI3L1 的敲低導致 U87MG 和 A172 細胞系中炎癥因子（如 TNFɑ、TGFβ、CXCR4、CXCL12、CCL2、CXCL8、NOS3 和 IL1β）的 mRNA 表達降低。此外，由于在克隆形成和 EdU 增殖測定中敲低 CHI3L1，U87MG 和 A172 細胞均顯示增殖率和存活率降低。CHI3L1 敲低的神經膠質瘤細胞也顯示出遷移能力降低。同時，經shCHI3L1慢病毒敲除CHI3L1的U87MG細胞的生長速度較慢。然后在裸鼠皮下注射U87MG細胞。結果CHI3L1基因敲除組腫瘤生長速度較慢，腫瘤大小也較對照組小?？傊?，體內和體外研究都表明CHI3L1調節膠質瘤細胞的增殖、遷移和存活。
結 論該研究表明CHI3L1促進了膠質瘤細胞內NF-κB通路的激活，并對TME進行了重新編程，因此是一個有希望的治療膠質瘤的靶點。
吉凱助力
本文中CHI3L1干擾慢病毒由吉凱基因提供，在體內體外實驗中均有很好的敲低效率。
公眾號底部菜單欄【新功能】上線！
病毒實驗幫
免費在線學習《國自然熱點研究》、《數據庫及軟件操作教程》
一鍵下載《病毒使用手冊》、《高分文獻》
還有不定時的送新書、抽獎活動，趕緊來掃碼關注一波吧
作者簡介
趙婷，復旦大學附屬腫瘤醫院內科基地住院醫師，復旦大學2022年“卓醫計劃”臨床博士后，2020年獲國家留學基金委公派留學赴新加坡國立大學國際癌癥中心博士聯合培養。博士期間發表第一作者及共同第一作者IF>10的SCI論文4篇，申報國jia級發明**1項。在校期間主持江蘇省研究生科研創新計劃3項，參與國家自然科學基金面上項目3項，榮獲國家獎學金4次及江蘇省優秀學生干部等榮譽和獎勵60余項。