qPCR常見問題及解決方案
對(duì)于從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)猿來說，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)可謂是老生常談了?？此骑L(fēng)平浪靜，只需“RNA提取-反轉(zhuǎn)錄-熒光定量”這些按部就班的操作，實(shí)則險(xiǎn)象環(huán)生，一丁點(diǎn)的出錯(cuò)都有可能讓我們懷疑人生。
即便如此，在CNS的召喚下我們?nèi)耘f一遍遍的重復(fù)、重復(fù)、再重復(fù)。小翊深有體會(huì)，為此嘔心瀝血整理出來常用的SYBR Green染料法RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)常見問題，并給出了可能的原因和解決方案，希望大家能夠順利度過RT-qPCR大關(guān)。
RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，大家或多或少會(huì)遇到擴(kuò)增曲線異常、熔解曲線異常和重復(fù)性不好的問題，可從以下幾個(gè)方面對(duì)癥分析。
擴(kuò)增曲線異常
正常的擴(kuò)增曲線一般呈S型，Ct值最好在20-30之間。異常的擴(kuò)增曲線包括曲線無平臺(tái)期、曲線呈鋸齒狀和Ct值偏大等現(xiàn)象。
1.?Ct值偏大（如Ct值＞30）
1）模板量低或基因表達(dá)豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應(yīng)倍數(shù)減少。
2）qPCR整個(gè)反應(yīng)條件不適宜或引物設(shè)計(jì)不當(dāng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，建議通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴(kuò)增效率。
3）擴(kuò)增產(chǎn)物過長(zhǎng)，建議用三步法程序擴(kuò)增或通過優(yōu)化引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度最好不超過300bp。
4）體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新制備純度更高的模板。
2.?擴(kuò)增曲線無法達(dá)到平臺(tái)期
基因豐度低、循環(huán)數(shù)較少，建議增加循環(huán)數(shù)或選擇適合低豐度基因定量的產(chǎn)品。
3.擴(kuò)增曲線平臺(tái)期鋸齒狀
1）RNA純度低，建議梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果或重新制備高純度RNA重新實(shí)驗(yàn)。
2）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。
4.有熔解曲線，無擴(kuò)增曲線
可能是擴(kuò)增程序設(shè)置錯(cuò)誤，未進(jìn)行熒光信號(hào)搜集，建議重新實(shí)驗(yàn)，增加擴(kuò)增程序中延伸階段熒光信號(hào)的搜集。
5.?陰性對(duì)照有擴(kuò)增
1）NTC有擴(kuò)增，可能有以下兩種情況：
①Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃（一般正常qPCR產(chǎn)物，大小在100-300bp之間，熔解曲線Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚體導(dǎo)致，可進(jìn)一步優(yōu)化引物。
②有Ct值且＜35，表示反應(yīng)體系被污染，可逐步排除污染源。
2）NRC有擴(kuò)增
NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建議用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。
【注】NTC是指將H2O代替模板的陰性對(duì)照反應(yīng)；NRC是指將未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板的陰性對(duì)照反應(yīng)。
6.復(fù)孔重復(fù)性差
1）加樣誤差導(dǎo)致，建議移液器定期校準(zhǔn)，另外可通過擴(kuò)大反應(yīng)體系或提前配制好預(yù)混液優(yōu)化。
2）模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。
3）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。
?
熔解曲線異常
熔解曲線常用來判斷qPCR結(jié)果的特異性，理想的熔解曲線為單峰，異常的熔解曲線會(huì)出現(xiàn)雜峰、雙峰、寬峰等可能的情況，下面我們來逐一分析。
1.熔解曲線出現(xiàn)雙峰
1）雙峰，較低峰Tm在80℃之前
可能存在引物二聚體,建議降低引物濃度或重新設(shè)計(jì)引物等方式優(yōu)化。
2）雙峰，雙峰Tm在80℃以后
①引物特異性過差導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，建議Blast檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
②gDNA污染，可通過NRC進(jìn)行確認(rèn)。若NRC有Ct值，可重新制備模板。
2.?熔解曲線單峰但不尖銳
可能存在大小相近的非特異性產(chǎn)物，建議進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳確認(rèn)。
3.熔解曲線單峰但Tm值在80℃以前
推測(cè)未加模板，僅有引物二聚體的擴(kuò)增。進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳確認(rèn)產(chǎn)物或重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
4.有擴(kuò)增曲線，無熔解曲線
可能是熔解程序設(shè)置錯(cuò)誤，未搜集熒光信號(hào)，建議重新實(shí)驗(yàn)，增加熔解曲線階段的信號(hào)搜集。
5.熔解曲線峰型雜亂
1）反應(yīng)體系污染，結(jié)合NTC和NRC結(jié)果確認(rèn)污染情況，建議從水，引物，酶和環(huán)境等逐一排除污染。
2）試劑暴露在強(qiáng)光或高溫下導(dǎo)致試劑失效，建議用新的試劑做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
3）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。
4）耗材與儀器不匹配，需確認(rèn)對(duì)應(yīng)儀器對(duì)耗材的要求。
6.兩種試劑對(duì)比，得到的Tm值不一樣
可能是不同試劑的促解鏈成分或含量不一樣，導(dǎo)致解鏈溫度Tm值不一樣。
?
以上就是小翊為大家整理的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問題及相應(yīng)的建議，希望對(duì)大家有所幫助