教你怎么做miRNA靶基因驗證（實驗篇）

在上期我們介紹了熱銷科研對象miRNA的靶基因預測，現在我們來介紹一下怎么用實驗方法來驗證我們的預測結果。又方便又有高認可度的miRNA靶基因驗證實驗就是雙熒光素酶報告基因實驗啦。

雙熒光素酶報告基因實驗是通過將預測能夠與miRNA結合的靶基因3’UTR序列插入載體中螢火蟲熒光蛋白（firefly luciferase）的3’UTR。當我們感興趣的miRNA和質粒中的插入序列結合后，miRNA會通過和所插入的序列結合從而抑制螢火蟲熒光蛋白的翻譯最終造成熒光值的下降。海腎素熒光蛋白（renilla luciferase）是作為內參來去除組間的轉染效率差異的。
其實你也可以理解為：用熒光值來判斷miRNA是否和靶基因結合。

在了解原理后我們來看一下要做一次熒光素酶報告實驗需要哪些東西：

1.細胞

許多同學固執的一定要選用目的細胞來做實驗，其實我們本來就是要驗證分子間的相互作用，細胞只是一個媒介或載體，選用工具細胞如293T、HEK293等即可。選擇工具細胞的條件總結如下：

1）好轉染、且轉染效率較高

2）目的microRNA的表達水平極低或不表達

2. 質粒

首先我們需要螢火蟲熒光素酶3’UTR插入目的序列的載體，通常我們管它叫野生型質粒。這里要注意哦，不一定要插入靶基因的3’UTR全長?？梢灾徊迦氚╩iRNA結合位點前后200bp左右的序列。有的基因3’UTR有幾千到上萬bp，要是你一定要插入全長的話，還能不能愉快的玩耍了？

其次我們需要螢火蟲熒光素酶3’UTR插入miRNA結合位點突變的序列載體，這個短語好長啊，請各位同學看清里面的定語。通常管它叫突變型質粒。這個質粒是整個實驗中至關重要的一部分。你能不能發現分子間的直接相互作用就靠它了，對它好一點哦。

當然，我們需要miRNA的過表達載體。這個不用多說了吧，沒有miRNA怎么做實驗呢。

最后也不能少了各種對照載體啊，包括螢火蟲熒光素酶空載體，miRNA空載體還有海腎素熒光載體。

下面我們還需要……沒了。就是這么任性！

隨后你會發現很熟悉有木有，好像都是實驗室現成的，或者能夠構建的，不用再去買抗體，探針，磁珠啥的了，這樣也能發現分子間直接相互作用？碉堡了！

當我們把家伙事兒都備齊了，問題又來了——怎么設計實驗分組?。?/span>

關于miRNA靶基因驗證的雙熒光素酶報告基因實驗分組，在經過這么多年這么多科學家前赴后繼的SCI大潮中，已經形成了一套標準。當然是領域頂尖的大佬們定的規矩，我們來看一下人家大佬的Cell文章是怎么做的。


這篇文章采用了經典的6組法，具體的實驗分組為：

是不是很復雜，結果看不懂？不用害怕，很多組都只是對照而已，真正要看的關鍵數據是第四組和第六組的數據，記住這句話：第四組數據死命低，其他各組數據差不多你就贏了！就是這么簡單，這么任性！

我們再來用學術語句描述一下：miRNA通過和靶基因結合后抑制靶基因的翻譯，從而導致螢火蟲熒光素發光值下降，當結合位點被突變后熒光值回復上升，證明miRNA確實通過結合位點調控靶基因。

對于有個性有追求的同學或者處女座的同學，還有更牛的9組法，其實就是在6組法的基礎上又加上了3種對照載體的分別單獨感染組，這樣你的實驗分組就完美了。

至此從miRNA靶基因預測到驗證的一個完整實驗就完成了，有木有感覺很容易呢，有志于miRNA研究的同學們好好準備一下開干吧！后續我們將會為大家介紹一些實驗過程中遇到的問題。