作者：沈毅輝
在過(guò)去的80年里，以蒽環(huán)素為基礎(chǔ)的化療被廣泛用于治療惡性和晚期腫瘤。不幸的是，根據(jù)以往的研究，蒽環(huán)類(lèi)藥物如doxorubicin（DOX，多柔比星，又名阿霉素）可導(dǎo)致心臟毒性并進(jìn)展為心力衰竭。雖然DOX引起的心臟毒性的多種分子機(jī)制已經(jīng)被報(bào)道過(guò)，但其中大部分歸因于心肌細(xì)胞中活性氧（ROS）的過(guò)量產(chǎn)生。右丙亞胺作為一種抗ROS療法已在臨床中使用中，臨床效果有限，并被證明會(huì)增加繼發(fā)性惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，這表明目前對(duì)DOX引起心臟毒性的認(rèn)識(shí)尚不全面。近期，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院程蕾蕾/趙健元教授研究團(tuán)隊(duì)在Cell death & disease雜志（IF：9.685 ）上在線發(fā)表題為“Tripartite motif 25 ameliorates doxorubicin-induced cardiotoxicity by degrading p85α”的文章，通過(guò)整合DOX心臟毒性細(xì)胞模型蛋白質(zhì)組和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中體內(nèi)模型轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，尋找參與其發(fā)病機(jī)制的潛在泛素化E3連接酶，其中，TRIM25是其中變化最明顯的泛素化E3連接酶，并且通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)泛素化E3連接酶TRIM25通過(guò)泛素化降解p85α減輕DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。吉?jiǎng)P基因提供了蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)、質(zhì)粒和腺病毒等服務(wù)和產(chǎn)品。
研究結(jié)果
1. 蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示TRIM25在DOX處理后發(fā)生顯著變化
作者分別用DOX或PBS處理小鼠心肌細(xì)胞HL-1（3vs.3） 16小時(shí)，并采用基于質(zhì)譜的TMT蛋白質(zhì)組學(xué)（由吉?jiǎng)P基因提供技術(shù)服務(wù)）檢測(cè)蛋白譜的變化。在檢測(cè)到的6326個(gè)蛋白中，顯著上調(diào)蛋白231個(gè)，顯著下調(diào)蛋白167個(gè)（fc>1.2或fc<0.83,p<0.05）。差異蛋白的KEGG富集分析顯示了與P53信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)通路的富集，表明DOX成功誘導(dǎo)了心臟毒性。研究者同時(shí)與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)體內(nèi)模型的轉(zhuǎn)錄組（GSE40289）數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，通過(guò)分析共有上調(diào)或下調(diào)的和泛素化相關(guān)基因，最終共得到6個(gè)泛素化相關(guān)基因（TRIM25、CBX4、HERC4、NSMCE2、UBE3C和ZFP91）在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的變化趨勢(shì)一致，而其中一個(gè)泛素化E3連接酶TRIM25在DOX誘導(dǎo)心臟毒性模型中表達(dá)變化最大。
作者在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRIM25，并使用DOX處理細(xì)胞。與PBS處理相比，DOX處理后顯著誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。而過(guò)表達(dá)TRIM25則可顯著減弱DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡，這表明，TRIM25有潛在的心臟保護(hù)作用。
隨后，作者檢測(cè)了DOX處理不同時(shí)間后TRIM25的表達(dá)變化。結(jié)果表明，TRIM25在DOX處理的早期顯著下調(diào)，而在DOX處理16h后表達(dá)開(kāi)始升高。因此，作者推測(cè)DOX處理早期導(dǎo)致的TRIM25低表達(dá)可能誘導(dǎo)了心臟毒性。在小鼠心肌細(xì)胞房HL-1和大鼠心肌細(xì)胞H9C細(xì)胞中都觀察到了在DOX處理的早期存在TRIM25表達(dá)的下降。而在一個(gè)DOX誘導(dǎo)的急性心臟毒性小鼠模型的心臟組織中也檢測(cè)到了TRIM25的下降。
2. TRIM25通過(guò)泛素化p85α增加其降解
TRIM25是個(gè)泛素E3鏈接酶，作者進(jìn)一步探究了TRIM25的心臟保護(hù)作用機(jī)制。首先作者過(guò)表達(dá)TRIM25并通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)和質(zhì)譜檢測(cè)TRIM25結(jié)合的蛋白，其中一個(gè)蛋白為p85α，并且在p85α的一個(gè)肽段上檢測(cè)到了泛素修飾位點(diǎn)。反向，過(guò)表達(dá)p85α后的IP-質(zhì)譜也檢測(cè)到了TRIM25。鑒于TRIM25和p85α表達(dá)的負(fù)相關(guān)性，作者認(rèn)為T(mén)RIM25可能通過(guò)調(diào)控p85α減輕DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。
隨后，作者檢測(cè)了TRIM25是否通過(guò)泛素化p85α調(diào)控其穩(wěn)定性和表達(dá)。shRNA敲低TRIM25會(huì)上調(diào)p85α的表達(dá)；TRIM25過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致p85α下調(diào)，而TRIM25敲低還可以延長(zhǎng)HEK293T細(xì)胞中p85α的半衰期；過(guò)表達(dá)突變導(dǎo)致的泛素E3連接酶功能缺失的TRIM25則不會(huì)影響p85α的表達(dá)變化。
GST Pull Down實(shí)驗(yàn)也再次確認(rèn)了TRIM25與p85α的互作。進(jìn)一步，作者通過(guò)表達(dá)一系列截短突變的TRIM25來(lái)檢測(cè)TRIM25和p85α互作的結(jié)構(gòu)域。TRIM25 PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域與p85α 結(jié)合，而p85α 的SH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ谒cTRIM25的互作至關(guān)重要。
3. TRIM25過(guò)表達(dá)可減輕DOX誘導(dǎo)的心臟毒性
作者通過(guò)AAV9在小鼠心臟中特異性過(guò)表達(dá)TRIM25（由吉?jiǎng)P基因提供），與對(duì)照組相比，TRIM25過(guò)表達(dá)組小鼠心臟纖維化、細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均得到了改善。
4. TRIM25減輕DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
前述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DOX處理后會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物BIP表達(dá)上升，而這種上升在TRIM25過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞中被逆轉(zhuǎn)。在DOX處理下，控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的未折疊蛋白應(yīng)答（UPR）信號(hào)上調(diào)。此外，還檢測(cè)到了JNK磷酸化信號(hào)的上調(diào)，表明在DOX誘導(dǎo)的調(diào)往中存在著UPR的不適應(yīng)性。相反地，TRIM25過(guò)表達(dá)減弱了DOX誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大。總體上，體外實(shí)驗(yàn)表明，TRIM25可減輕DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
5. TRIM25通過(guò)泛素化p85α使其降解進(jìn)而抑制未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）
TRIM25顯著減輕了DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而p85α敲低影響了TRIM25的心臟保護(hù)功能。p85α過(guò)表達(dá)顯著消除了TRIM25過(guò)表達(dá)對(duì)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的益處。進(jìn)一步的研究表明，p85α過(guò)表達(dá)后XBP-1s（一個(gè)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子）的核轉(zhuǎn)位減少。IP實(shí)驗(yàn)也明確了p85α和XBP-1s間的相互作用。這種作用會(huì)被DOX處理減弱，這也降低了XBP-1s的核轉(zhuǎn)位，最終導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增強(qiáng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，DOX處理后p85α上調(diào)，這也意味著XBP-1s核轉(zhuǎn)位的下降。
6. p85α 過(guò)表達(dá)或激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均可消除TRIM25的心臟保護(hù)作用
考慮到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DOX誘導(dǎo)的心臟毒性之間的聯(lián)系，作者檢測(cè)了一個(gè)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激化學(xué)分子伴侶——牛磺熊去氧膽酸（TUDCA）在DOX誘導(dǎo)的心肌病中的作用。結(jié)果表明TUDCA可以改善心臟功能和心肌萎縮，減少心肌纖維化的面積。
TRIM25在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中起的保護(hù)作用與p85α下調(diào)及p85α在非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）中的作用相關(guān)。研究者通過(guò)尾靜脈注射AAV使p85α在小鼠心臟中特異性過(guò)表達(dá)。在同時(shí)過(guò)表達(dá)TRIM25和p85α的小鼠中，TRIM25的心臟保護(hù)作用被削弱。一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素（TM）處理后，也得到了類(lèi)似的結(jié)果。過(guò)表達(dá)p85α或TM處理均可以影響小鼠心臟的收縮性，導(dǎo)致心臟萎縮。此外，作者還檢測(cè)到了心臟纖維化和凋亡。這些結(jié)果明確了TRIM25引起的p85α下調(diào)在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中的保護(hù)作用。
作者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)DOX處理后心肌細(xì)胞中發(fā)生變化的與泛素化相關(guān)的蛋白，并通過(guò)與一個(gè)公開(kāi)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，鎖定了一個(gè)泛素E3連接酶TRIM25。隨后，作者通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)和機(jī)制實(shí)驗(yàn)明確了：
（1）TRIM25可以降低DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，緩解 DOX誘導(dǎo)的心臟毒性；
（2）TRIM25通過(guò)抑制心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR通路激活從而緩解DOX誘導(dǎo)的心臟毒性；
（3）TRIM25通過(guò)泛素化p85α促進(jìn)其降解從而增加了 XBP-1s的核轉(zhuǎn)位來(lái)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
吉?jiǎng)P助力
該研究中使用的蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序、質(zhì)粒載體以及TRIM25、p85α的過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒等均由吉?jiǎng)P基因提供。
作者簡(jiǎn)介
復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院程蕾蕾/趙健元教授為論文通訊作者，沈毅輝博士為文章第一作者。
程蕾蕾
吉?jiǎng)P基因憑借多年在靶標(biāo)篩選及驗(yàn)證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標(biāo)準(zhǔn)化 、工程化 、系統(tǒng)化的GRP平臺(tái)，為中國(guó)研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化。其中，多組學(xué)平臺(tái)包含蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)和高通量測(cè)序平臺(tái)：
·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)擁有多臺(tái)timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專(zhuān)業(yè)的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專(zhuān)業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質(zhì)組等檢測(cè)服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測(cè)序平臺(tái)分為常規(guī)測(cè)序服務(wù)和單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)：單細(xì)胞測(cè)序擁有10x和BD兩個(gè)平臺(tái)，提供單細(xì)胞RNA-seq、單細(xì)胞核測(cè)序、單細(xì)胞混樣RNA-seq、單細(xì)胞TCR/BCR、單細(xì)胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等服務(wù)；常規(guī)測(cè)序服務(wù)提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測(cè)序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修飾測(cè)序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測(cè)序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（兩文庫(kù)/三文庫(kù)）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務(wù)