作者：沈毅輝
在過去的80年里，以蒽環素為基礎的化療被廣泛用于治療惡性和晚期腫瘤。不幸的是，根據以往的研究，蒽環類藥物如doxorubicin（DOX，多柔比星，又名阿霉素）可導致心臟毒性并進展為心力衰竭。雖然DOX引起的心臟毒性的多種分子機制已經被報道過，但其中大部分歸因于心肌細胞中活性氧（ROS）的過量產生。右丙亞胺作為一種抗ROS療法已在臨床中使用中，臨床效果有限，并被證明會增加繼發性惡性腫瘤的發生風險，這表明目前對DOX引起心臟毒性的認識尚不全面。近期，復旦大學附屬中山醫院程蕾蕾/趙健元教授研究團隊在Cell death & disease雜志（IF：9.685 ）上在線發表題為“Tripartite motif 25 ameliorates doxorubicin-induced cardiotoxicity by degrading p85α”的文章，通過整合DOX心臟毒性細胞模型蛋白質組和GEO數據庫中體內模型轉錄組數據，尋找參與其發病機制的潛在泛素化E3連接酶，其中，TRIM25是其中變化最明顯的泛素化E3連接酶，并且通過驗證發現泛素化E3連接酶TRIM25通過泛素化降解p85α減輕DOX誘導的心臟毒性。吉凱基因提供了蛋白質組學服務、質粒和腺病毒等服務和產品。
研究結果
1. 蛋白質組學聯合轉錄組學分析顯示TRIM25在DOX處理后發生顯著變化
作者分別用DOX或PBS處理小鼠心肌細胞HL-1（3vs.3） 16小時，并采用基于質譜的TMT蛋白質組學（由吉凱基因提供技術服務）檢測蛋白譜的變化。在檢測到的6326個蛋白中，顯著上調蛋白231個，顯著下調蛋白167個（fc>1.2或fc<0.83,p<0.05）。差異蛋白的KEGG富集分析顯示了與P53信號通路和細胞周期相關通路的富集，表明DOX成功誘導了心臟毒性。研究者同時與GEO數據庫中一個體內模型的轉錄組（GSE40289）數據進行整合分析，通過分析共有上調或下調的和泛素化相關基因，最終共得到6個泛素化相關基因（TRIM25、CBX4、HERC4、NSMCE2、UBE3C和ZFP91）在兩個數據集中的變化趨勢一致，而其中一個泛素化E3連接酶TRIM25在DOX誘導心臟毒性模型中表達變化最大。
作者在心肌細胞中過表達TRIM25，并使用DOX處理細胞。與PBS處理相比，DOX處理后顯著誘導了細胞凋亡。而過表達TRIM25則可顯著減弱DOX誘導的心肌細胞的凋亡，這表明，TRIM25有潛在的心臟保護作用。
隨后，作者檢測了DOX處理不同時間后TRIM25的表達變化。結果表明，TRIM25在DOX處理的早期顯著下調，而在DOX處理16h后表達開始升高。因此，作者推測DOX處理早期導致的TRIM25低表達可能誘導了心臟毒性。在小鼠心肌細胞房HL-1和大鼠心肌細胞H9C細胞中都觀察到了在DOX處理的早期存在TRIM25表達的下降。而在一個DOX誘導的急性心臟毒性小鼠模型的心臟組織中也檢測到了TRIM25的下降。
2. TRIM25通過泛素化p85α增加其降解
TRIM25是個泛素E3鏈接酶，作者進一步探究了TRIM25的心臟保護作用機制。首先作者過表達TRIM25并通過免疫共沉淀(Co-IP)和質譜檢測TRIM25結合的蛋白，其中一個蛋白為p85α，并且在p85α的一個肽段上檢測到了泛素修飾位點。反向，過表達p85α后的IP-質譜也檢測到了TRIM25。鑒于TRIM25和p85α表達的負相關性，作者認為TRIM25可能通過調控p85α減輕DOX誘導的心臟毒性。
隨后，作者檢測了TRIM25是否通過泛素化p85α調控其穩定性和表達。shRNA敲低TRIM25會上調p85α的表達；TRIM25過表達則導致p85α下調，而TRIM25敲低還可以延長HEK293T細胞中p85α的半衰期；過表達突變導致的泛素E3連接酶功能缺失的TRIM25則不會影響p85α的表達變化。
GST Pull Down實驗也再次確認了TRIM25與p85α的互作。進一步，作者通過表達一系列截短突變的TRIM25來檢測TRIM25和p85α互作的結構域。TRIM25 PRY/SPRY結構域與p85α 結合，而p85α 的SH2結構域對于它與TRIM25的互作至關重要。
3. TRIM25過表達可減輕DOX誘導的心臟毒性
作者通過AAV9在小鼠心臟中特異性過表達TRIM25（由吉凱基因提供），與對照組相比，TRIM25過表達組小鼠心臟纖維化、細胞凋亡、內質網應激均得到了改善。
4. TRIM25減輕DOX誘導的心肌細胞內質網應激
前述實驗發現DOX處理后會導致內質網（ER）的增大，內質網應激的標志物BIP表達上升，而這種上升在TRIM25過表達的心肌細胞中被逆轉。在DOX處理下，控制內質網應激的未折疊蛋白應答（UPR）信號上調。此外，還檢測到了JNK磷酸化信號的上調，表明在DOX誘導的調往中存在著UPR的不適應性。相反地，TRIM25過表達減弱了DOX誘導的內質網增大。總體上，體外實驗表明，TRIM25可減輕DOX誘導的心肌細胞內質網應激。
5. TRIM25通過泛素化p85α使其降解進而抑制未折疊蛋白反應（UPR）
TRIM25顯著減輕了DOX誘導的細胞凋亡，而p85α敲低影響了TRIM25的心臟保護功能。p85α過表達顯著消除了TRIM25過表達對減輕內質網應激的益處。進一步的研究表明，p85α過表達后XBP-1s（一個減輕內質網應激的重要轉錄因子）的核轉位減少。IP實驗也明確了p85α和XBP-1s間的相互作用。這種作用會被DOX處理減弱，這也降低了XBP-1s的核轉位，最終導致了內質網應激的增強。免疫熒光實驗表明，DOX處理后p85α上調，這也意味著XBP-1s核轉位的下降。
6. p85α 過表達或激活內質網應激均可消除TRIM25的心臟保護作用
考慮到內質網應激和DOX誘導的心臟毒性之間的聯系，作者檢測了一個抗內質網應激化學分子伴侶——?；切苋パ跄懰幔═UDCA）在DOX誘導的心肌病中的作用。結果表明TUDCA可以改善心臟功能和心肌萎縮，減少心肌纖維化的面積。
TRIM25在DOX誘導的心臟毒性中起的保護作用與p85α下調及p85α在非折疊蛋白反應（UPR）中的作用相關。研究者通過尾靜脈注射AAV使p85α在小鼠心臟中特異性過表達。在同時過表達TRIM25和p85α的小鼠中，TRIM25的心臟保護作用被削弱。一個內質網應激誘導劑衣霉素（TM）處理后，也得到了類似的結果。過表達p85α或TM處理均可以影響小鼠心臟的收縮性，導致心臟萎縮。此外，作者還檢測到了心臟纖維化和凋亡。這些結果明確了TRIM25引起的p85α下調在DOX誘導的心臟毒性中的保護作用。
作者通過蛋白質組學檢測DOX處理后心肌細胞中發生變化的與泛素化相關的蛋白，并通過與一個公開的轉錄組測序數據進行整合，鎖定了一個泛素E3連接酶TRIM25。隨后，作者通過功能實驗和機制實驗明確了：
（1）TRIM25可以降低DOX誘導的心肌細胞凋亡，緩解 DOX誘導的心臟毒性；
（2）TRIM25通過抑制心肌細胞的內質網應激和UPR通路激活從而緩解DOX誘導的心臟毒性；
（3）TRIM25通過泛素化p85α促進其降解從而增加了 XBP-1s的核轉位來降低內質網應激。
吉凱助力
該研究中使用的蛋白質組學測序、質粒載體以及TRIM25、p85α的過表達腺相關病毒等均由吉凱基因提供。
作者簡介
復旦大學附屬中山醫院程蕾蕾/趙健元教授為論文通訊作者，沈毅輝博士為文章第一作者。
程蕾蕾
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