蛋白質免疫印跡法常見問題及解答
無信號
1、一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物種相同（一抗來自鼠，二抗便是抗鼠抗體）。
2、沒有足夠的一抗或二抗結合目標蛋白：使用高濃度抗體。4℃延長孵育時間。（如過夜）
3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應：使用溫和的去污劑，如吐溫-20，或更換封閉劑（常用脫 脂奶粉、BSA、血清、明膠）。
4、一抗不識別待檢物種的蛋白：參照說明書，對比免疫原序列和蛋白序列以確保抗體和目的 蛋白會發生反應。設置陽性對照。
5、蛋白上樣量不足：每條泳道蛋白上樣量不超過 20ug，使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照。
6、組織中目的蛋白含量低：濃縮使信號最大化。
7、轉膜不充分：使用可逆染色劑檢測轉膜效果，檢查轉膜操作是否正確。PVDF 膜需預先浸 在甲醇中，然后浸到轉移緩沖液中。
8、洗膜過度：勿過度洗膜
9、過度封閉使目標蛋白不能顯色：使用 0.5％奶粉或無奶粉代替 5％奶粉的抗體稀釋液。或更 換封閉膜，減少封閉時間。
10、一抗失效：使用新鮮抗體，重復使用有效濃度會降低。
11、二抗受疊氮鈉抑制：避免疊氮鈉和 HRP 標記抗體一起使用。
12、檢測試劑盒過期和底物失活：使用新鮮的底物。
背景高
1、未進行特異性封閉或封閉不充分：延長封閉時間，考慮更換合適的封閉劑。
2、一抗濃度過高：稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體延長孵育時間（耗時長，但特異 性結合最好）。
3、二抗與封閉劑非特異性結合或反應：設置二抗對照（不加一抗）。
4、未結合蛋白質洗滌不充分：增加洗滌次數。
5、選膜不當產生的高背景：**纖維素膜比 PVDF 膜背景低
6、膜干燥：在孵育過程中防止膜變干，每一步都要保證膜有充分的反應液，可放入攪拌子不 斷攪動或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。
多帶現象
1、細胞傳代次數過多，蛋白表達不同：使用原始未傳代的細胞株，和現在的細胞株一起做平 行對照實驗。
2、體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?；?、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等： 參考文獻，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來證明翻譯后的修飾。
3、蛋白樣本降解（蛋白質分子量降低）：在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。
4、檢測到未經報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結構不同的蛋白：查閱其他 文獻報道，或 BLAST 搜尋，使用說明書推薦的細胞株或組織。
5、一抗濃度過高，高濃度時常出現多條蛋白帶：降低蛋白帶和/或孵育時間。
6、二抗濃度過高，高濃度產生非特異性結合：降低抗體濃度，加入二抗對照（不加一抗）。
7、抗體未經純化：使用親和純化的抗體，減少非特異條帶。
8、目標蛋白形成多聚體：SDS-PAGE 電泳加樣前，煮沸 10 min 而不是 5 min，使蛋白質解聚。
背景有不均勻的白色斑點
轉膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均：轉膜過程中盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動。
背景有黑色斑點
抗體結合了封閉劑：過濾封閉劑 深
背景出現白色條帶
一抗或二抗加入過多：稀釋抗體的濃度
目的條帶染色過低/過高
1、分離不徹底
2、改變凝膠比例：分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。
條帶“微笑”效應
1、遷移過快
2、電泳溫度過高（改變了 PH 值和遷移速度）。降低遷移速度或低溫電泳。（冷庫或冰上）。
相同蛋白雜交出現了不均勻條帶
1、制備凝膠時，凝膠凝固太快，致使泳道中丙.烯.酰.胺的比例不均勻。
2、參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量 TEMED，放置時在凝膠頂部加入適量 0.1％SDS（水 稀釋）以防凝膠變干。
凝膠染色不均勻
1、細菌污染：4℃保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡膠體。
2、抗體量不足：確保振蕩條件下孵育膜或抗體充分覆蓋膜。
·
蛋白質免疫印跡法常見問題及解答
作者：西安百螢生物科技有限公司 2019-01-22T09:49 (訪問量:7477)
西安百螢生物科技有限公司 商家主頁
地 址： 西安市高新區草堂科技產業基地秦嶺大道西6號科技企業加速器二區9幢2單元20401號房
聯系人： 第五經理
電 話： 029-68064558
傳 真： 029-68064558
Email：info@tjbiolite.com;zx@tjbiolite.com
相關咨詢
流式多色Panel新選擇 | PE-Cy5預活化染料，讓抗體標記一步到位！ (暫無發布時間 瀏覽數:6754)
PE-Cy5.5 標記試劑盒｜流式實驗不費力 (暫無發布時間 瀏覽數:5146)
R-藻紅蛋白（PE）| 高亮度熒光標記蛋白，流式多色實驗的理想選擇 (暫無發布時間 瀏覽數:6779)
PE-iFluor? 594串聯染料：多色流式的高亮度新選擇 (暫無發布時間 瀏覽數:7473)
從常規標記到超分辨成像，一款染料夠用嗎？AATOM? 給出肯定答案 (暫無發布時間 瀏覽數:8005)
告別光漂白與低信噪比？AATOM? 標記染料：為嚴苛熒光應用打造的高性能方案 (暫無發布時間 瀏覽數:9347)
讓每一個分子都清晰可辨——AATOM 488 四嗪，重新定義超分辨成像的可靠性 (暫無發布時間 瀏覽數:7946)
深度解析 | AATOM? 514 馬來酰亞胺：為何它是巰基標記與超分辨成像的優選染料？ (暫無發布時間 瀏覽數:9271)
做了3次標記實驗都失敗了？你可能缺了這款“又亮又穩”的綠色熒光染料 (暫無發布時間 瀏覽數:9887)
AATOM 488 四嗪：為超分辨成像與精準標記打造的熒光新標桿 (暫無發布時間 瀏覽數:10227)
ADVERTISEMENT