當我們開始跑步的時候往往伴隨著我們的呼吸的變化，以便我們在新陳代謝需求增加的情況下保持平衡。呼吸的變化通常表現為呼吸頻率和呼吸量的增加。但是關于相關的細胞和神經的環路還不是很清楚。今年5月份，法國Julien Bouvier教授在Nature Communication上發表了一篇名為Upregulation of breathing rate during running exercise by central locomotor circuits in mice［1］的文章詳細的為我們介紹了運動時和呼吸相關的兩條環路。
其中一條通路來源于中腦運動區（MLR），一個保守的運動控制器。通過直接投射到產生呼吸節律的前伯欽格復合體（preB?tC）的神經元上。在運動發生之前，觸發呼吸頻率的適當增加。另一條環路是含有后肢體回路的脊髓的腰部擴大部分。當運動發生時，通過投射到后梯狀核（RTN），也能夠有力的調節呼吸頻率。
實驗結果
一、谷氨酸能的CnF神經元投射到preB?tC
首先，研究人員研究了小鼠中促進運動的MLR神經元是否和參與呼吸節律的神經元之間是否有接觸。研究人員通過在Vglut2Cre成年小鼠中單側立體注射Cre依賴性AAV-eYFP，追蹤CnF神經元的投射。豐富的eYFP陽性纖維在preB?tC中檢測到，這些投射以同側為主。（圖1c、d、g）。與此相反，在PF呼吸區的投射很少。（圖1f）。為了進一步驗證CnF神經元靶向前preB?tC神經元，作者利用基因限制的雙病毒的方法，從解剖學上揭示了前preB?tC的假定輸入。作者注射了順行的Cre依賴性狂犬病輔助病毒(HSV-LSL-TVA-oG43)在一側的preB?tC中，然后在對側的preB?tC中注入EnvAΔG狂犬?。≧b）病毒（圖1h）。結果表明，Rb病毒在投射的神經元即preB?tC神經元中的表達。經過突觸的擴散在雙側的CnF和PPN中都能檢測到以及對側的preB?tC和NTS都能檢測到，只有少數在PF區能夠檢測到。總的來說，作者通過注射順行和逆行病毒的方式證明了，Glut+CnF神經元直接與前B?tC的候選呼吸節律生成神經元接觸，而不是pF區。
CnF谷氨酸神經元與呼吸發生器preB?tC相聯系
二、谷氨酸能的CnF神經元能夠調節呼吸節律的產生
接下來，研究人員測試了谷氨酸能的CnF神經元在功能上對preB?tC的影響。作者通過AAV將興奮性的光敏蛋白ChR2表達在Vglut2Cre成年小鼠的CnF神經元中，并且在注射的部位上植入了一根光纖。并且利用全身測壓法對呼吸的周期進行測量。研究人員發現，對Glut+CnF神經元的單側光刺激引起了異位的吸氣爆發，并縮短了呼吸。這種影響在早期呼氣的時候提供光脈沖的效果最為突出。（圖2c）。接下來對前B?tC中表達ChR2的纖維進行光激活。表達的纖維在CnF中注入病毒后，在preB?tC中光活化。(圖2d）。這導致了類似的相位依賴性的呼吸周期的縮短。這些結果都表明，Glut+CnF神經元投射到preB?tC神經元，并且實驗驗證了preB?tC神經元對吸氣爆發生成的興奮性調節。
光激活CnF神經元會影響preB?tC呼吸節律的產生
三、谷氨酸能的CnF神經元會協同調節呼吸和運動
為了獲得劇烈位移運動中的呼吸參數，研究人員使用了最近開發的膈?。―iaEMG）的慢性肌電圖記錄，Vglut2Cre動物被制成在Glut+CnF神經元中表達ChR2。動物被植入EMG，并被放置于一個線性的走廊里，以1s的脈沖頻率進行光照。從側面對動物進行拍攝，使用視頻記錄他們的位移速度。結果發現，給予CnF神經元15Hz的光刺激可以使動物參與到運動行為中，更高頻的光刺激會使動物的運動速度變快。研究人員發現，CnF的光激活和增加的呼吸頻率有關。（圖3b、c）。并且通過進一步分析20Hz光刺激的時候小鼠的運動狀態，可以分成兩種運動狀態“pre-loco”以及“loco”狀態。（圖3d）。研究人員發現DiaEMG的振幅在前Loco階段沒有明顯的變化，但在后Loco階段有明顯的變化。（圖3e、f）。并且在給予15Hz以下的光照時，呼吸的頻率會隨著光照的頻率加快而加快。（圖3g、h）?？偟膩碚f，這些結果表明：1）Glut+CnF神經元可以在運動前，甚至在沒有運動的情況下，上調呼吸頻率；2）在CnF誘發的運動過程中，當實際運動時，呼吸頻率從靜止狀態上升到最高水平；3）在 "運動 "階段，呼吸頻率的增加與在 "運動 "階段呼吸頻率的增加與位移速度成正比，以及4）呼吸不與周期性的肢體運動相鎖定。
谷氨酸能的CnF神經元能夠上調呼吸的頻率即使是在運動沒有發生的時候
四、脊髓運動環路會投射到PF呼吸區
之后研究人員想要探究這種快速的運動是否和更強的驅動呼吸的中樞有關，這個中樞和錐體的運動環路有關。因此作者在Vglut2 Cre小鼠的腰部脊髓進行了大體積的Cre依賴性AAV-eYFP注射。（圖4a）。結果研究人員發現，在preB?tC區的投射很少，但是在PF區存在大量投射。通過對PF區進行分層，結果發現主要是在中間的PF區有熒光的表達。為了進一步確定腰椎到PF區是通過突觸進行傳遞的，研究人員在Vglut2 Cre小鼠腰椎部位注射了AAV-DIO Syp-eYFP，在PF區發現了熒光的表達。接著研究人員在野生型的小鼠的腰椎部位先注射了順行的AAV1-Syn-Cre，之后在PF腦區注射AAV-DIO-eYFP，結果發現PF區存在熒光的表達。已知，PF區不能投射到腰椎部位，所以PF腦區的熒光不是由腰椎部位的AA1順行傳遞到PF區的，而是通過順行突觸實現的。即上升的脊柱突觸的目標是pF呼吸區。
五、腰椎的運動環路通過RTNPhox2b/Atoh1的神經元調節呼吸頻率
為了探究腰椎的運動環路能否功能性的上調呼吸的頻率，研究人員使用了體外分離的新生小鼠的腦干/脊髓。使用分體式浴盆對腦干和脊髓進行了獨立的藥理操作，進一步記錄第四頸椎腹側的呼吸樣活動。結果發現加入神經活性物質NMDA和5-HT可以使脊柱區間誘發的呼吸頻率明顯上升。當把頸椎橫斷之后，呼吸樣的頻率增加消失了。之前的結果表明PF呼吸區是脊髓的上升通路的候選目標。接下來通過完全橫斷PF來消除物理性的呼吸區。加入活性物質之后，呼吸頻率并沒有明顯改變。接著通過將RTN神經元中PHOX2b的突變等位基因時刪除之后給予神經活性物質，發現其呼吸頻率并沒有進一步上升。這些實驗的結果都表明脊柱腰椎環路是通過RTN的RTNPhox2b/Atoh1神經元來調節呼吸活動。
藥理上激活類似運動的活動會增加體內吸氣的頻率，這需要TNPhox2b/Atoh1的完整性
六、沉默RTNPhox2b/Atoh1神經元會降低運動時的呼吸頻率
對于RTNPhox2b/Atoh1神經元在體內的重要作用，研究人員想要進一步在運動的時候對于呼吸頻率的調節。研究人員使用了Phox2b/Atoh1表達才會表達Cre的小鼠的PF腦區注射了Cre依賴的AAV，編碼抑制性的DREADD受體hM4Di。結果表明在PF腦區有綠色熒光，即AAV在此表達。之后給予靜止和運動的小鼠CNO，結果表明在小鼠靜止的時候，CNO給藥對小鼠的吸氣頻率、吸氣和呼氣的持續時間沒有明顯的影響。在小鼠運動的時候，給予CNO，會顯著降低呼吸的頻率。這些結果表明，RTNPhox2b/Atoh1神經元的活動是在跑步運動中調節呼吸頻率所必需的。
七、RTNPhox2b/Atoh1神經元可以投射到preB?tC呼吸感受器
為了進一步去確定RTNPhox2b/Atoh1神經元是否會影響到主要的吸氣發生器preB?tC。研究人員在PF腦區注射了Cre依賴的AAV編碼的ChR2。通過對preB?tC腦區進行免疫熒光的檢測發現有熒光的表達。即 RTNPhox2b/Atoh1神經元可以投射到preB?tC。并且研究人員進一步通過全身測壓儀器發現單邊對RTNPhox2b/Atoh1神經元的光刺激可以引起異位的吸氣爆發并縮短呼吸周期（圖7e、f）。此外，對RTNPhox2b/Atoh1神經元的1秒光刺激導致了刺激期間呼吸頻率明顯增加，主要是由于Te的減少，甚至在最低的刺激頻率下（圖7g，h）。在Atoh1FRTCre;Phox2bFlpo動物的pF區注射Cre依賴性AAV編碼的eYFP后，在preB?tC中檢測到eYFP點（圖7i, j）?？偟膩碚f，這些結果表明，RTNPhox2b/Atoh1神經元可以通過通過直接投射到前B?tC來調節呼吸速率。
總 結
長期以來，在運動過程中呼吸過度的假說一直都有，但是對于其中的細胞和環路還不是很清楚。這篇文獻主要發現了兩個系統，通過這兩個系統，和運動有關的中央網絡可以使呼吸頻率增加。在靜止的狀態下，在沒有從CnF到運動中心模式發生器（lCPG）的運動啟動信號的情況下，preB?tC驅動基礎吸氣率。CnF激活導致動物在進行有效的奔跑之前通氣量增加。“preoco ”階段歸因于CnF向preB?tC發送直接和快速的激活信號（粗線）。CnF信號在到達運動性CPG之前要穿過多個突觸（虛線），這可能支持運動性開始的較長延遲。CnF的激活最終導致了跑步的發生，在此期間，通氣量進一步增加。這種效應是由于激活的lCPG向pF的呼吸區發出直接的投射，并在一定程度上部分投射到RTN Phox2b/Atoh1神經元，這些神經元反過來接觸并激活preB?tC (粗線)。
環路的圖示
本文中作者為了證明相關通路，使用了大量的順行、逆行的病毒。通過病毒示蹤的方式去證明自己的邏輯閉環。各位老師在自己的實驗中也可以借鑒相關思路選擇合適的病毒助力自己的實驗。近期，吉凱基因在病毒購買上優惠多多，簽約課題組定制病毒享59折優惠，詳情請聯系當地銷售工程師，也可以添加吉凱客服咨詢相關優惠政策。
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【參考文獻】
［1］Bouvier, Julien., et al., Upregulation of breathing rate during running exercise by central locomotor circuits in mice. Nat Commun,2023.14(1):p.2939.