編者按
外泌體（exosome）是由大多數(shù)類型細胞分泌的直徑為30~100nm的微小膜囊泡，廣泛存在于各種體液（血液、尿液、乳汁等）及細胞培養(yǎng)上清中。外泌體攜帶了蛋白質(zhì)、脂類、核酸（miRNA、mRNA）等多種物質(zhì)，在局部微環(huán)境調(diào)節(jié)和細胞間通訊發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。
外泌體被認為在肝癌（HCC）的發(fā)展進程中起了十分重要的作用。但外泌體調(diào)控HCC轉(zhuǎn)移的分子機制并不明確。2021年4月HEPATOLOGY（IF 17.425）雜志發(fā)表了題為“M2 Macrophage–Derived Exosomes Facilitate HCC Metastasis by Transferring αMβ2 Integrin to Tumor Cells”的研究成果，該研究主要揭示了外泌體調(diào)控HCC遷移和肺轉(zhuǎn)移的具體分子機制。研究結(jié)果表明M2 exos(M2巨噬細胞分泌的外泌體)上的整合蛋白CD11b/CD18通過上調(diào)MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)誘導(dǎo)了HCC的遷移、侵襲和肺轉(zhuǎn)移。中科新生命在本次研究中提供了外泌體蛋白組學服務(wù)。
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M2 Macrophage‐Derived Exosomes Facilitate HCC Metastasis by Transferring αMβ2 Integrin to Tumor Cells
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◆ 主要內(nèi)容
1. CD206+TAMs與肝癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)
為了驗證HCC轉(zhuǎn)移與巨噬細胞相關(guān)，本研究使用癌旁組織、HCC癌組織、非轉(zhuǎn)移HCC癌組織和轉(zhuǎn)移癌組織檢測巨噬細胞標志物的表達水平。免疫組化實驗結(jié)果顯示癌組織的CD68（巨噬細胞標志物）、CD206(TAM(M2巨噬細胞)標志物)水平明顯高于癌旁組織（圖1A-1D），轉(zhuǎn)移HCC組織中的CD206水平也明顯高于非轉(zhuǎn)移HCC組織（圖1E和1F）。
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圖1 巨噬細胞標志物在不同組織中的表達
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2. CD206+ M2極化巨噬細胞通過分泌的外泌體促進肝癌細胞的遷移和侵襲
為了驗證巨噬細胞的生物學功能，在體外實驗使用THP-1單層細胞來模擬人巨噬細胞。M2-THP-1巨噬細胞與HepG2和Huh7（人肝癌細胞）共培養(yǎng)，結(jié)果證明M2巨噬細胞顯著性增強了HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲潛能（圖2A和2B）。HepG2和Huh7細胞使用M2極性巨噬細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，其遷移能力和侵襲能力也均有明顯提高（圖2C-2F）。上述實驗證明M2極性巨噬細胞能激發(fā)肝癌細胞的遷移能力。
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圖2 M2巨噬細胞促進肝癌的轉(zhuǎn)移
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3.外泌體促進肝癌細胞的遷移和侵襲
為了驗證外泌體在增強肝癌細胞遷移中發(fā)揮的作用，使用從M2巨噬細胞培養(yǎng)基中分離出的外泌體（圖3A-3C）處理肝癌細胞，結(jié)果顯示M2 exos顯著提高了HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲能力（圖3D-3G）。而在M2巨噬細胞培養(yǎng)基中加入GW4869（外泌體分泌抑制劑）做Transwell侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)M2 THP-1巨噬細胞不能促進HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲能力（圖3H和3I）。體內(nèi)實驗也驗證了M2 exos促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力。M2 exos處理HepG2和Huh7細胞24hr后收集并注射入小鼠體內(nèi)（圖4A和4C）。三周后取肺組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種M2 exo處理的HepG2和Huh7細胞的小鼠的肺部轉(zhuǎn)移灶明顯增多，且總生存期也明顯縮短（圖4B和圖4D）。
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圖3和圖4 外泌體促進肝癌細胞遷移
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4. 蛋白質(zhì)組學篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白--CD18和CD11b
為了驗證M2 exos上哪些蛋白介導(dǎo)肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，作者使用LC-MS/MS的方法進行M1及M2 exos外泌體蛋白質(zhì)高通量篩選。通過組學實驗篩選得到一系列差異表達蛋白，并選擇了與免疫細胞功能相關(guān)的蛋白進行Western blot驗證。通過驗證實驗發(fā)現(xiàn)CD18和CD11b在M2 exos中高表達（圖5A和5B），且在M2 exos處理的HepG2和Huh7細胞中，CD11b/CD18與外泌體共定位（圖5C和5D）且其蛋白水平也顯著提高（圖5E和5F）。
圖5 外泌體蛋白質(zhì)組學篩選及驗證
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5. CD11b/CD18 在肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用
為了驗證CD11b/CD18在肝癌細胞遷移中發(fā)揮的作用，作者在HepG2和Huh7細胞中加入M2 exos、CD11b和/或CD18阻斷抗體開展transwell實驗，結(jié)果表明加入阻斷抗體后能明顯抑制M2 exos處理的HepG2和Huh7細胞從上室轉(zhuǎn)移至下室（圖6A和6B）。體內(nèi)實驗也表明CD11b/CD18阻斷抗體能顯著抑制M2 exos誘導(dǎo)的HepG2和Huh7腫瘤肺轉(zhuǎn)移（圖6C和圖6E），同時延長了小鼠壽命（圖6D和圖6F）。
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圖6 外泌體功能蛋白驗證
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6. MMP-9介導(dǎo)M2 exos誘導(dǎo)的肝癌細胞遷移和肺轉(zhuǎn)移
為了深入研究M2 exos的CD11b/CD18調(diào)控肝癌細胞遷移和侵襲的機制，本研究中使用定量PCR、WB、ELISA方法驗證MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)的表達。結(jié)果表明MMP-9在M2 exos處理的肝癌細胞中表達量上升、在加入CD11b/CD18阻斷抗體后被顯著抑制（圖7A-7F）。在transwell實驗（圖8A）和傷口愈合實驗（圖8B和8C）中，加入CP471474（MMP-9抑制劑）與M2 exos處理的HepG2和Huh7細胞相比，肝癌細胞的遷移能力明顯降低，肝癌細胞肺轉(zhuǎn)移也明顯降低（圖8D）。
圖7和圖8 外泌體蛋白通過MMP-9介導(dǎo)肝癌細胞的遷移和肺轉(zhuǎn)移
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◆ 小結(jié)
外泌體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用，該研究通過蛋白質(zhì)組學的方法揭示了外泌體引起肝細胞癌（HCC）轉(zhuǎn)移的具體作用分子機制，為HCC的診斷找到了新的靶點，為腫瘤轉(zhuǎn)移的機制研究提供了新思路。