編者按
外泌體（exosome）是由大多數類型細胞分泌的直徑為30~100nm的微小膜囊泡，廣泛存在于各種體液（血液、尿液、乳汁等）及細胞培養上清中。外泌體攜帶了蛋白質、脂類、核酸（miRNA、mRNA）等多種物質，在局部微環境調節和細胞間通訊發揮了至關重要的作用。
外泌體被認為在肝癌（HCC）的發展進程中起了十分重要的作用。但外泌體調控HCC轉移的分子機制并不明確。2021年4月HEPATOLOGY（IF 17.425）雜志發表了題為“M2 Macrophage–Derived Exosomes Facilitate HCC Metastasis by Transferring αMβ2 Integrin to Tumor Cells”的研究成果，該研究主要揭示了外泌體調控HCC遷移和肺轉移的具體分子機制。研究結果表明M2 exos(M2巨噬細胞分泌的外泌體)上的整合蛋白CD11b/CD18通過上調MMP-9(基質金屬蛋白酶9)誘導了HCC的遷移、侵襲和肺轉移。中科新生命在本次研究中提供了外泌體蛋白組學服務。
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M2 Macrophage‐Derived Exosomes Facilitate HCC Metastasis by Transferring αMβ2 Integrin to Tumor Cells
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◆ 主要內容
1. CD206+TAMs與肝癌轉移和預后相關
為了驗證HCC轉移與巨噬細胞相關，本研究使用癌旁組織、HCC癌組織、非轉移HCC癌組織和轉移癌組織檢測巨噬細胞標志物的表達水平。免疫組化實驗結果顯示癌組織的CD68（巨噬細胞標志物）、CD206(TAM(M2巨噬細胞)標志物)水平明顯高于癌旁組織（圖1A-1D），轉移HCC組織中的CD206水平也明顯高于非轉移HCC組織（圖1E和1F）。
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圖1 巨噬細胞標志物在不同組織中的表達
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2. CD206+ M2極化巨噬細胞通過分泌的外泌體促進肝癌細胞的遷移和侵襲
為了驗證巨噬細胞的生物學功能，在體外實驗使用THP-1單層細胞來模擬人巨噬細胞。M2-THP-1巨噬細胞與HepG2和Huh7（人肝癌細胞）共培養，結果證明M2巨噬細胞顯著性增強了HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲潛能（圖2A和2B）。HepG2和Huh7細胞使用M2極性巨噬細胞培養基培養，其遷移能力和侵襲能力也均有明顯提高（圖2C-2F）。上述實驗證明M2極性巨噬細胞能激發肝癌細胞的遷移能力。
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圖2 M2巨噬細胞促進肝癌的轉移
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3.外泌體促進肝癌細胞的遷移和侵襲
為了驗證外泌體在增強肝癌細胞遷移中發揮的作用，使用從M2巨噬細胞培養基中分離出的外泌體（圖3A-3C）處理肝癌細胞，結果顯示M2 exos顯著提高了HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲能力（圖3D-3G）。而在M2巨噬細胞培養基中加入GW4869（外泌體分泌抑制劑）做Transwell侵襲實驗，發現M2 THP-1巨噬細胞不能促進HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲能力（圖3H和3I）。體內實驗也驗證了M2 exos促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力。M2 exos處理HepG2和Huh7細胞24hr后收集并注射入小鼠體內（圖4A和4C）。三周后取肺組織，結果發現接種M2 exo處理的HepG2和Huh7細胞的小鼠的肺部轉移灶明顯增多，且總生存期也明顯縮短（圖4B和圖4D）。
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圖3和圖4 外泌體促進肝癌細胞遷移
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4. 蛋白質組學篩選轉移相關蛋白--CD18和CD11b
為了驗證M2 exos上哪些蛋白介導肝癌細胞的轉移，作者使用LC-MS/MS的方法進行M1及M2 exos外泌體蛋白質高通量篩選。通過組學實驗篩選得到一系列差異表達蛋白，并選擇了與免疫細胞功能相關的蛋白進行Western blot驗證。通過驗證實驗發現CD18和CD11b在M2 exos中高表達（圖5A和5B），且在M2 exos處理的HepG2和Huh7細胞中，CD11b/CD18與外泌體共定位（圖5C和5D）且其蛋白水平也顯著提高（圖5E和5F）。
圖5 外泌體蛋白質組學篩選及驗證
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5. CD11b/CD18 在肝癌轉移中發揮重要作用
為了驗證CD11b/CD18在肝癌細胞遷移中發揮的作用，作者在HepG2和Huh7細胞中加入M2 exos、CD11b和/或CD18阻斷抗體開展transwell實驗，結果表明加入阻斷抗體后能明顯抑制M2 exos處理的HepG2和Huh7細胞從上室轉移至下室（圖6A和6B）。體內實驗也表明CD11b/CD18阻斷抗體能顯著抑制M2 exos誘導的HepG2和Huh7腫瘤肺轉移（圖6C和圖6E），同時延長了小鼠壽命（圖6D和圖6F）。
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圖6 外泌體功能蛋白驗證
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6. MMP-9介導M2 exos誘導的肝癌細胞遷移和肺轉移
為了深入研究M2 exos的CD11b/CD18調控肝癌細胞遷移和侵襲的機制，本研究中使用定量PCR、WB、ELISA方法驗證MMP-9(基質金屬蛋白酶9)的表達。結果表明MMP-9在M2 exos處理的肝癌細胞中表達量上升、在加入CD11b/CD18阻斷抗體后被顯著抑制（圖7A-7F）。在transwell實驗（圖8A）和傷口愈合實驗（圖8B和8C）中，加入CP471474（MMP-9抑制劑）與M2 exos處理的HepG2和Huh7細胞相比，肝癌細胞的遷移能力明顯降低，肝癌細胞肺轉移也明顯降低（圖8D）。
圖7和圖8 外泌體蛋白通過MMP-9介導肝癌細胞的遷移和肺轉移
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◆ 小結
外泌體在腫瘤的發生發展和轉移過程中發揮了舉足輕重的作用，該研究通過蛋白質組學的方法揭示了外泌體引起肝細胞癌（HCC）轉移的具體作用分子機制，為HCC的診斷找到了新的靶點，為腫瘤轉移的機制研究提供了新思路。