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?背景有黑點(diǎn)，怎么辦？?詳情信息 1、封閉液未溶完全解決： A.確認(rèn)BSA/牛奶有完全溶解，建議增加溶解時(shí)間或溶解后取上清液使用。 B.利用0.45um濾紙過濾溶液，也可使用商品化試劑，如GTX30964（Trident Universal Protein Blocking Reagent，適用于WB、IHC、ICC/IF、ELISA）。 C.改變緩沖液，如換為BSA。 2、溶液污染 解決： 使用現(xiàn)配的溶液（Running/transfer/blocking/wash buffers）或商業(yè)化溶液減少因長(zhǎng)菌長(zhǎng)霉造成的黑點(diǎn)。
3、封閉液及抗體交互作用 解決：一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會(huì)與磷酸化抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合。因此，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液，同時(shí)洗脫溶液也用TBST，如此可降低黑點(diǎn)高背景的情況。 |
| ?過曝，怎么辦？?詳情信息 1、蛋白樣品過量 解決： 降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高（如β-actin），此時(shí)可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。 2、抗體過量 解決： A.增加抗體稀釋倍數(shù)。 B.減少孵育時(shí)間，一般孵育時(shí)間為37℃，1小時(shí)。 C.于4℃過夜孵育，減少抗體非特異性結(jié)合。 3、訊號(hào)過曝 解決： A.縮短曝光時(shí)間。 B.使用低靈敏的ECL。 |
| ?拖帶，怎么辦？?詳情信息 1、樣品不純，有雜質(zhì)污染 解決： A.重新離心樣品，取上清液使用。 B.使用較純的試劑配制細(xì)胞裂解液或購買商業(yè)化產(chǎn)品。 C.使用Benzonase®核酸酶，Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度，減少核酸對(duì)跑膠的干擾。 D.全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取，使用商業(yè)化全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取試劑盒提取蛋白樣品，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。 2、蛋白樣品過量 解決： A.降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高(如beta actin)，此時(shí)可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。 B.蛋白變性不完全，也會(huì)使條帶成團(tuán)拖曳；此時(shí)，可通過延長(zhǎng)樣品加熱時(shí)間(一般約5分鐘)及調(diào)整SDS(一般是2 %)比例，使蛋白變性更完全。 3、訊號(hào)過曝 解決： A.縮短曝光時(shí)間。 B.使用低靈敏的ECL。 |
| ?條帶扭曲，怎么辦？?詳情信息 1、膠沒配好 解決： A.確保APS＆TEMED正常，并新鮮配制膠體。 B.空的泳道加Sample Buffer 2、電流電壓?jiǎn)栴} 解決： 避免膠體過熱。電壓過高也會(huì)出現(xiàn)微笑、歪斜條帶等條帶，建議上層濃縮膠使用80V；下層分離膠使用100-120V。另外也需檢查電泳槽是否有銹蝕造成電流不穩(wěn)。過熱時(shí)可改為在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳。 3、轉(zhuǎn)膜問題 解決： 小心滾壓膠體并確保與膜貼合，有時(shí)出現(xiàn) 2個(gè)條帶是因?yàn)檗D(zhuǎn)膜時(shí)不小心移動(dòng)到膜產(chǎn)生疊影。 |
| ?高背景，怎么辦？?詳情信息 1、封閉問題 解決： A.確認(rèn)封閉完全。封閉作用不足，這是其中一種可能的原因，提高封閉物濃度可確保封閉液完全覆蓋轉(zhuǎn)印膜，如使用5% 脫脂奶粉或BSA。 B.封閉液不與抗體反應(yīng)。這種情況較常發(fā)生在磷酸化抗體的使用過程中，由于牛奶含有casein這種磷酸蛋白，因此如果使用牛奶當(dāng)封閉液，封閉液與磷酸化抗體可能會(huì)產(chǎn)生非特異性的結(jié)合。這個(gè)情況下，建議使用BSA作為封閉液，同時(shí)搭配使用TBST的洗脫液來幫助降低高背景值的狀況。 C.封閉時(shí)間增加，一般情況會(huì)使用室溫37度封閉1小時(shí)，可視情況調(diào)整封閉的條件。 2、膜的問題 解決： A.選擇合適的膜（可參考詳情信息） B.膜干掉，建議整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都須注意讓膜保持濕潤(rùn)，特別是PVDF膜。 C.膜沒有完全均勻濕透，PVDF膜較會(huì)出現(xiàn)這個(gè)狀況，使用PVDF膜前，需用100% methanol完全浸潤(rùn)膜。 3、抗體問題 解決： A.降低抗體濃度 B.以陽性對(duì)照確認(rèn)二抗 C.足夠的洗脫時(shí)間和次數(shù) 4、呈色問題 解決： ECL呈色問題造成高背景值的原因，可能是因?yàn)榛瘜W(xué)顯色底物過多；建議按說明書加入適量的顯色底物。 |
| ?非特異性條帶，怎么辦？?詳情信息 1、蛋白降解 解決： A.加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解。 B.冰上操作。 C.避免反復(fù)凍融樣品（建議分裝）；建議使用新鮮制備的樣品。
2、蛋白形成多聚體 解決：A.使用現(xiàn)配的DTT/2-ME并將加熱時(shí)間延長(zhǎng)，幫助打斷多聚體的雙硫鍵。 B.樣本煮沸溫度達(dá)到95℃-100℃。 3、確認(rèn)蛋白特性 解決： 查詢生物信息是否有后修飾、剪切體等。 4、抗體濃度過高/蛋白樣品過量 解決： A.增加抗體稀釋倍數(shù)，也可調(diào)整孵育時(shí)間，并在4℃孵育。 B.減少上樣量。 5、抗體非特異性結(jié)合 解決： A.增加洗膜次數(shù)與時(shí)間或在洗滌液里改用不同強(qiáng)度的detergent或是增加濃度。 B.設(shè)對(duì)照組來確認(rèn)抗體非專一性結(jié)合可能的原因，例如：是否有目標(biāo)蛋白表達(dá)。 6、抗體檢測(cè)到heavy/light chain的信號(hào) 解決： 這種情況通常發(fā)生在IP實(shí)驗(yàn)里，GeneTex有一系列可避免辨認(rèn)heavy/light chain的特制二抗，其設(shè)計(jì)原理是用來辨認(rèn)native的一抗結(jié)構(gòu)。（可參考詳情信息） |
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