類器官構建完成后總要進行一系列的染色：

首先，染色可以幫助研究人員更清晰地觀察和研究類器官的結構和形態。通過染色，類器官的細胞和組織可以被賦予不同的顏色或熒光特性，從而使其在顯微鏡下更易于觀察和識別。這有助于研究人員更準確地分析類器官的細胞組成、排列方式以及細胞間的相互作用。

其次，染色可以揭示類器官的特定生物學特性。不同的染色方法可以用于檢測類器官中的特定分子、蛋白質或基因表達，從而深入了解類器官的功能和機制。這些信息對于理解類器官的發育、生理和病理過程至關重要。

此外，染色還有助于研究人員進行定量分析。通過對染色后的類器官進行圖像分析和數據處理，可以定量評估類器官的大小、細胞數量、細胞增殖率等參數。這對于評估類器官的生長狀態、藥物反應以及疾病模型的建立具有重要意義。

最后，染色還可以用于類器官的鑒定和分類。通過特定的染色方法，可以將不同類型的類器官區分開來，從而便于研究人員進行針對性的研究。

那么我們就來看看類器官怎么染色：

好看的類器官都是染出來的，你可能不信,確實，除了染色，一臺4通道的共聚焦顯微鏡也很重要。

染色需要的材料：
正常血清（使用與產生第二抗體相同的物種）

牛血清白蛋白

Triton™X-100

吐溫®20

D-PBS

200µL寬口徑移液管尖端（Corning®，T-205-WB-C-R-S）

4%溶解了多聚甲醛的PBS溶液

DAPI

檸檬酸鹽緩沖液

從Matrigel中回收類器官

注：此優化適用于直徑在50至500µm之間的類器官。建議每個面板至少使用100個類器官，。如果類器官的直徑小于50µm，請繼續培養。如果類器官的直徑為1毫米或更大，則該方案不適用。

注：類器官懸浮液（即在不存在Matrigel®或具有非膠凝Matrigel™濃度的情況下生長）不需要回收。

用防粘連清洗液（我采用的是0.9%的氯化鈉溶液)預沖洗15 mL錐形管。上下顛倒輕輕搖晃，以確保管壁涂有沖洗溶液。

注：預沖洗可防止類有機物粘附在培養物上，并顯著提高類有機物的回收率。

操作步驟：

1. 從孔板吸出培養基棄掉，PBS清洗兩次，并向孔中加入1mL預熱的細胞解離試劑

注：我采用的是啟達組織消化酶（SD0013)

2. 切下1 mL移液管尖端（或使用寬口徑移液管末端），并用防粘連沖洗液進行預沖洗。使用相同的尖端（輕輕地）研磨孔板兩次，然后將類器官轉移到步驟1中制備的管中。

注：將孔板底分解成更小的碎片可以更有效地消化Matrigel®。從Matrigel®中釋放類器官對于防止Matrigel™干擾下游染色非常重要。避免過度或苛刻的研磨，這可能會剪切或損壞類器官。

3.將管子側面放在冰上。將冰盒放在旋轉或傾斜平臺上，攪拌Matrigel®-類有機懸浮液20分鐘。

4.用防粘連沖洗溶液切割并預沖洗1 mL移液管尖端（或使用寬孔移液管末端），然后使用相同的尖端（輕輕地）研磨Matrigel®碎片。

5.將試管放回冰上，在攪拌下再孵育20分鐘。

注：當Matrigel®溶解并且類器官開始在懸浮液中漂浮時，培養完成；這可能需要長于1小時的孵育。

6.600-800轉離心讓類器官在重力作用下沉淀。

7.吸取上清液，上清液中應含有大部分Matrigel®。繼續進行類器官固定步驟。

注：如果需要做多重染色，每個抗體板只染色一個孔板。例如，如果你打算用4個不同的抗體染色，可以從4個孔板收集類器官。注意，根據每個孔板的類器官數量，可能需要進行一些優化。當一個類器官要染多種顏色的時候，需要確保抗體組合來自不同物種，以避免染色過程中的交叉反應。

固定

化學固定有兩種主要方法：脫水和交聯。脫水固定劑（如甲醇）去除并取代蛋白質周圍的游離水，導致蛋白質變性和原位沉淀。交聯固定劑（如多聚甲醛）與蛋白質發生化學反應，形成分子間和分子內共價橋。脫水通常會導致更高的免疫反應性，但形態較差，蛋白質損失高。交聯導致極好的形態結構，但也可導致表位掩蔽和抗體排斥。應通過實驗確定每個組織和每個抗體-抗原相互作用的最佳固定方法。一般來說，PFA固定后再進行抗原回收可獲得最佳結果。

1. 用防粘連沖洗液預沖洗1.7 mL微量離心管。

2. 從類器官沉淀中取出上清液，并將類有機物重懸于1 mL 4%PFA中。

3. 在防粘連沖洗溶液中預先沖洗1 mL移液管尖端，并使用相同的尖端將類有機物從15 mL錐形管輕輕轉移到步驟1中制備的微量離心管中。

4. 將試管放在一邊，在PFA中輕輕搖晃45分鐘。

注：盡管不同組織的最佳固定時間因其大小和密度（以及固定劑的類型）而異，但45-60分鐘的固定時間將確保大多數形狀和大小的類器官（即直徑達500µm的類器官）的完全固定。
孵育期后，在IF緩沖液中洗滌類有機物一次，以消除殘留的PFA。洗滌后讓類器官沉淀。

注意：一般情況下，進行一次清洗就足夠了。如果需要，可以進行第二次洗滌，洗滌后需要離心收集類器官

5. 將類器官重新懸浮在1mL PBS中，并進行抗原回收步驟。

注：類器官可在2-8°C的PBS中長期儲存；但會導致抗原丟失，所以請立即進行下一步

抗原回收

一些固定劑導致表位交聯，從而掩蓋表位并減少抗原-抗體結合。雖然抗原回收通常被推薦用于基于福爾馬林的固定劑，但其需求將取決于幾個因素，如靶抗原、使用的抗體、組織類型以及固定的方法和持續時間。當對某些抗原（例如角蛋白8/18）進行染色時，抗原回收是必不可少的，但對其他抗原（例如乙酰化微管蛋白）是可選的。固定在甲醇或其他有機溶劑中的樣品不應進行抗原回收。

注：抗原回收僅適用于固定在PFA或其他交聯劑中的樣品。用酒精或其他脫水型固定劑固定的樣品不應煮沸。

1.吸取PBS并向類器官中加入1mL檸檬酸緩沖液。

2.將1.7 mL試管加熱塊設置為98°C。一旦加熱塊達到96-98°C，將試管放在加熱塊中并孵育20分鐘。

3.關閉加熱塊。讓類有機物在加熱塊中再放置20分鐘，同時冷卻。

注意：注意：此時管子可能會很熱。如果需要，用鑷子取下管子

4.繼續滲透和封堵步驟。

細胞滲透和阻斷

注：細胞的滲透作用僅用于細胞內靶標。如果評估表面標記，則無需進行滲透處理。甲醇固定樣品可能不需要滲透。

1. 通過向滲透性溶液中加入5%血清形成滲透性/封閉性溶液。

注：用于阻斷的動物血清應與第二抗體的宿主相同。例如，如果你計劃使用驢二次抗體，這一步應該使用驢血清。每次添加新鮮血清（即不要將滲透/封閉溶液與血清長期儲存）。

2. 吸取檸檬酸鹽緩沖液，向類有機物中加入1 mL滲透/封閉溶液。將試管側放在滴定平臺上，在室溫下攪拌培養1-72小時。

注：潛伏期可能需要針對每種組織、抗原和抗體進行優化。然而，潛伏期通常在1-72小時之間，背景信號幾乎沒有差異。

注：如果細胞已固定在PFA中，則考慮在阻斷前用0.3M甘氨酸洗滌類器官30分鐘。甘氨酸將與未反應的醛基結合，以猝滅PFA自發熒光，并防止游離醛與一級或二級抗體反應，從而引起高背景信號。

預染

1. 吸入滲透/封閉溶液，在IF緩沖液中洗滌3次。在每次洗滌之間讓類器官靜置5分鐘。

2. 加入0.5 mL-1 mL一級抗體混合物。在IF緩沖液中制備初級抗體。

注：強烈建議在這一點上留出一些類器官，用作同種型對照和/或僅用于二級對照——特別是如果抗原罕見或抗體是新的。

3. 將試管側放在傾斜平臺上，在室溫下輕輕攪拌培養16-72小時。

注：類器官全懸置的典型一抗稀釋液為1:400-1:800；根據抗體的需要進行滴定。抗體不同，稀釋的倍數也會不同，需要自己去優化稀釋倍數。使用盡可能少的抗體來減輕背景信號。

復染

注：第二抗體的典型抗體稀釋度在1:500和1:1000之間。根據抗體的不同進行優化稀釋倍數.

1. 吸取初級抗體溶液，在IF緩沖液中洗滌3次。在每次洗滌時讓類器官靜置5分鐘。

2. 加入0.5 mL-1 mL的第二抗體混合物。在補充有10%驢血清的IF緩沖液中制備第二抗體。

注：第二抗體必須針對與第一抗體相同的同種類型進行培養。例如，如果使用小鼠IgM作為主要免疫球蛋白，則需要使用抗小鼠IgM來作為次要免疫球蛋白。

3. 將試管側放在傾斜平臺上，在室溫下輕輕攪拌培養16-72小時。在培養過程中，避免將類器官暴露在光線下。

注：在一級或二級抗體孵育后期間，類器官都可以在2-8°C的IF緩沖液（不含抗體）中儲存3天以下（在黑暗中，不搖晃）。為了獲得最佳效果，請盡快執行下一步操作。

注意：為了最大限度地減少背景熒光或虛假信號，重要的是，您的共軛二級抗體的發射光譜不要彼此廣泛重疊。請參閱制造商的規范，以確定所需熒光劑的激發光譜和發射光譜。

包埋

1. 將DAPI直接加入類器官中，最終濃度為2-4µg/mL。將試管放在一邊，在室溫下在黑暗中輕輕攪拌培養15-20分鐘。

注：如果需要，可以在添加DAPI之前對樣品進行清洗

注：如果用DAPI進行復染，最好使用紅色或遠紅色的次級抗原來檢測核抗原，以確保任何DAPI溢出到下游通道都不會提供假陽性。

2. 抽吸DAPI/類器官溶液，在水中和PBS中洗滌一次類器官。每次洗滌之間讓類器官靜置5分鐘。

注：在這個階段，類器官可以轉移到玻璃底室載玻片上（例如來自Ibidi的8孔室載玻片），并在PBS中成像，而不需要清除。但是清除以獲得最佳結果。

清理和固化

注：強烈建議進行光學清理。該工藝不僅通過減少光散射來提高整體信噪比，還可以保護熒光團和染料免受猝滅（褪色）。免疫標記和清除的類器官可以在室溫下儲存在ProLong™Gold Antifade Mountant中長達6個月，信號強度損失最小。

1. 吸取上清液，將類器官沉淀重懸于1 mL 50%甲醇PBS中。將試管側放在傾斜平臺上，在室溫下在黑暗中輕輕攪拌至少1小時。

2. 取出50%甲醇溶液，向類器官中加入1mL 100%甲醇。將試管側放在傾斜平臺上，在室溫下在黑暗中輕輕攪拌至少1小時。

3. 使用200µL移液管末端，盡可能多地吸出甲醇溶液。

4. 在50µL金防垢劑中重新懸浮類有機顆粒。

5. 將類器官懸液均勻滴到玻璃顯微鏡載玻片的中心。

注意：安裝件很粘稠。緩慢抽吸和滴入以避免氣泡。對于較大的類器官，需要在抽吸前剪掉200µL移液管尖端。

將蓋玻片放在類器官上，輕輕蓋住。

注：從一面向另一面輕輕蓋住，不要產生氣泡，使用指甲油密封

在成像之前，讓貼片固化至少24小時。

                                                                     腎類器官未染色前

                                                                                              染色后

                                                                            小鼠腸類器官

                                                            小鼠小腸類器官染色