冷凍保存細胞并創建自己的生物樣本庫是每個研究人員都需要經歷的問題，無論是細胞株還是原代細胞，抑或是用于再生醫學的間充質干細胞，冷凍保存可確保再生醫學應用的高質量細胞隨時可用。它允許標準化并減少對新鮮細胞分離的依賴。

冷凍細胞后我們總會在復蘇的時候遇到各種各樣的問題：
1. 細胞活力降低： 在冷凍過程中，細胞中的水會形成冰晶，冰晶會刺穿細胞膜并破壞內部結構，導致細胞死亡。冷凍過程中水分的去除會導致細胞內溶質濃度發生變化，從而產生滲透壓，導致細胞收縮并破壞細胞成分。

2. 冷凍保護劑的毒性： 二甲基亞砜 (DMSO)、甘油 (GLY)、乙二醇 (EG) 或丙二醇 (PG) 等冷凍保護劑 (CPA) 是必不可少的，因為它們有助于減少冰晶形成并保護細胞膜。雖然 CPA 是必不可少的，但它們在高濃度下可能會產生細胞毒性。找到冷凍保護和細胞毒性之間的最佳平衡至關重要。

3. 細胞特性喪失：比如在凍存間充質干細胞的時候， ECM 為 MSC 保持其干細胞特性和分化潛能提供了重要線索。冷凍保存會破壞這些相互作用，從而可能影響間充質干細胞自我更新和分化為特殊細胞類型的能力。冷凍和解凍會改變表觀遺傳景觀間充質干細胞是 DNA 上的化學修飾，可調節基因表達。這些變化會影響對干細胞和分化至關重要的基因的表達。

4. 標準化問題： 不同實驗室的冷凍保存方案差異很大，冷凍/解凍速率、冷凍保護劑濃度和細胞培養條件各不相同。這種不一致可能導致每個實驗室的細胞活力、細胞特性和整體功能性方面的結果各不相同。

怎么才能成功的凍存細胞：

一、準備階段

將凍存管、離心管、移液管等耗材準備齊全，放入超凈臺中，打開紫外線照射30分鐘進行消毒。同時，打開通風機通風3分鐘，并用75%酒精擦拭操作臺和雙手，確保操作環境的無菌狀態。此外，還需準備好冰盒，以及預熱至37℃的完全培養基、DMSO、胰酶等試劑。

二、細胞選擇與處理

1.選擇處于對數生長期、致密度約為80-90%、活力達90%以上的細胞進行凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。

2.取出細胞，進行酒精消毒后放入超凈臺。按照細胞傳代步驟，對細胞進行消化、解離。消化好的細胞離心后，棄掉上清液。

三、配置凍存液與重懸細胞

1.配置細胞凍存液，常用比例為無血清培養基：血清：DMSO=7：2：1，或含20%血清培養基、10%DMSO。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色，可以用0.22微米濾膜過濾，或直接購買無菌產品。凍存液應提前配制，防止臨時配制產生的熱量損傷細胞。

2.用凍存液重懸細胞，用移液器輕柔吹打細胞，避免損傷細胞。同時，混勻DMSO要快，因為DMSO對細胞有毒性，混合后應盡快凍存。

四、細胞計數與分裝

1.可用細胞計數板或計數儀器對細胞進行計數，將細胞總數調節至適宜范圍，如1×10^6個/ml。

2.將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般2ml凍存管裝入1-1.5ml細胞凍存懸液為宜。然后密封凍存管，并標記好細胞名稱、日期、細胞狀態以及凍存者姓名等信息。

五、細胞凍存

1.按照-4℃30分鐘、-20℃30分鐘、-80℃過夜、液氮保存的順序進行凍存。

2.細胞凍存是慢凍的過程，目的是使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶從而降低對細胞的傷害。對于大多數細胞來說，每分鐘降1-3℃是標準的降溫方法。

凍存細胞需要注意的問題：

1.DMSO本身就有滅菌的作用，因此使用前不需要進行高壓滅菌。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，降低冷凍保存效果。

2.在常溫下，DMSO對人體有害，應注意生物安全防護。

3.凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。

4.細胞不可長期保存在-80℃冰箱中，建議在-80℃冰箱中的保存時間不要超過48小時，然后盡快轉移至液氮中長期保存。

在這里介紹下我們的免程序降溫凍存液，公司有以下兩款自研的配方：

一、低血清免程序降溫凍存液

1. 免程序凍存，細胞凍存后直接放-80°保存即可，若細胞長期不用建議液氮保存

2. 低血清+蛋白組分，滿足細胞在休眠時的營養需求，適合珍稀細胞和原代細胞及細胞保種

3. 平衡冷凍劑組分，減少細胞毒性

二、無血清/無蛋白組分免程序降溫凍存液

1. 免程序降溫，凍存后直接放-80°即可，若細胞長期不用建議液氮保存

2. 凍存液組分明確，不含動物源組分不含生長因子

3. 仿血液內氨基酸營養組分，滿足細胞休眠的營養所需

4. 平衡的冷凍保存劑組分，減少細胞毒性；

5. 適用于血液細胞、無血清培養細胞及其他腫瘤細胞的長期保存

怎么確定復蘇的細胞沒有問題：

1 復蘇的細胞存活率高，在85%以上。這意味著大部分細胞在復蘇過程中保持了活力，是細胞復蘇成功的一個重要指標。

2 觀察復蘇后的細胞形態，確保它們與正常生長的細胞形態一致，沒有出現異常形態或細胞碎片。

3 檢查復蘇后的細胞生長速度，如果它們能夠在適當的培養條件下正常增殖，說明復蘇的細胞具有正常的生長能力。

4 進行必要的細胞功能檢測，如酶活性測定、蛋白質表達分析等，以進一步確認復蘇的細胞功能正常。

5 定期對復蘇后的細胞進行傳代培養，觀察其長期生長情況和穩定性，確保復蘇的細胞能夠持續保持正常狀態。