病毒載體生產過程中，可以通過評估HCD的殘留來對非特異性核酸酶的使用進行優化，主要包括以下步驟：
1）分析檢測未處理的過程中間品中HCD殘留量和HCD片段大小分布；
2）根據非特異性核酸酶的酶活計算所需酶量；Benzonase可參照以下公式：
X（u/ml）=DNA濃度（ug/ml）/37
3）設定梯度酶濃度（如0.5×，1×，2×，3×等），作用時間（如1、2、4、8、12、24小時等），作用溫度（20，25，37℃）及測試規模；
4）收集不同工藝點核酸酶處理后的樣品，檢測HCD殘留和HCD片段大小分布。
圖1 不同酶量、不同孵育時間核酸酶處理后，HCD殘留量和HCD大小分布情況
基因治療用病毒載體實際生產過程中，需要規?；腉MP級質粒用于轉染步驟，過程還涉及質粒制備（圖2）。因此，除了工藝引入的非特異性核酸酶中存在的宿主DNA殘留外，還需嚴格控制質粒E.coli宿主細胞殘留DNA、RNA和殘留蛋白。
圖2 基因治療用病毒載體生產流程[2]
需要特別注意的是，FDA提醒使用HEK293T細胞生產病毒載體時因存在SV40 T抗原，還需要檢測殘留的腺病毒E1（E1A & E1B）和SV40 T抗原序列。《中國藥典》有關生物制品宿主殘留核酸質量控制要求和CDE頒布的《細胞治療產品申請臨床試驗藥學研究和申報資料的考慮要點》中關于質粒和病毒載體的質量標準也提到，如使用HEK293細胞進行病毒載體生產，需進行宿主DNA和RNA殘留、SV40大T抗原DNA殘留、E1A和E1B基因DNA殘留檢測。
圖3 六種 HEK293 細胞系的譜系關系示意圖[1]
劃重點：
?非特異性核酸酶廣泛應用于病毒載體生產中的核酸殘留消解；
?對病毒載體生產過程中相關DNA需要全面檢測分析，包括病毒載體包裝生產所用的細胞系HCD，特定細胞系所攜帶的風險基因，以及HCD的片段分布；
?高品質全面的HCD及風險基因DNA檢測試劑盒使得核酸酶處理工藝的優化保證了穩定的殘留核酸清除和高質量的病毒載體。
湖州申科基于基因治療用病毒載體生產相關質控風險，研發了一系列具有自主知識產權的宿主細胞DNA殘留量及片段分析檢測試劑盒、HEK293細胞系HCD和相關風險基因檢測試劑盒，以及非特異性核酸酶殘留檢測試劑盒等，能夠快速檢測基因治療產品研發和生產過程的中間品、半成品和成品中核酸和由此引入的工藝雜質殘留。
HEK293細胞系殘留DNA檢測及風險基因檢測
| 貨號 | 產品名稱 |
| 1101104 | HEK293殘留DNA檢測試劑盒 |
| 1201202 | 293T總RNA殘留檢測試劑盒 |
| SK030213SV100 | SV40LTA & E1A殘留DNA檢測試劑盒 |
| 1101109 | E1A殘留DNA檢測試劑盒 |
| 1101110 | E1B殘留DNA檢測試劑盒 |
宿主細胞殘留DNA/RNA檢測
| 貨號 | 產品名稱 |
| SK030207H100 | Human 殘留 DNA 檢測試劑盒 |
| SK030202E100 | E.coli 殘留 DNA 檢測試劑盒 |
| 1201201 | E.coli 總RNA殘留檢測試劑盒 |
| SK030217PL100 | 質粒 DNA殘留檢測試劑盒 |
| SK030204V100 | Vero 殘留 DNA 檢測試劑盒 |
宿主細胞殘留DNA片段分析檢測
| 貨號 | 產品名稱 |
| 1103171-2 | E.coli殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103170-2 | CHO殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103173 | Human殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103174 | Vero殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103175 | MDCK殘留DNA片段分析檢測試劑盒 |
湖州申科作為生物制藥質量分析專用試劑的國內主要供應商，核心產品在FDA備案了DMF，多項發明專利應用于藥品法規的技術通則，成功支持多家客戶進行中、美、歐的IND及BLA申報。
參考文獻：
[1] Magdalena Malm.Evolution from adherent to suspension:systems biology of HEK293 cell line development [J].Scientifc Reports,(2020) 10:18996
[2] Jane F. Barlow.Insights on Successful Gene Therapy Manufacturing and Commercialization[EB/OL].https://go.pall.com/genetherapyebook.html,2021-1-12