病毒載體生產(chǎn)過程中，可以通過評估HCD的殘留來對非特異性核酸酶的使用進(jìn)行優(yōu)化，主要包括以下步驟：
1）分析檢測未處理的過程中間品中HCD殘留量和HCD片段大小分布；
2）根據(jù)非特異性核酸酶的酶活計算所需酶量；Benzonase可參照以下公式：
X（u/ml）=DNA濃度（ug/ml）/37
3）設(shè)定梯度酶濃度（如0.5×，1×，2×，3×等），作用時間（如1、2、4、8、12、24小時等），作用溫度（20，25，37℃）及測試規(guī)模；
4）收集不同工藝點(diǎn)核酸酶處理后的樣品，檢測HCD殘留和HCD片段大小分布。
圖1 不同酶量、不同孵育時間核酸酶處理后，HCD殘留量和HCD大小分布情況
基因治療用病毒載體實際生產(chǎn)過程中，需要規(guī)模化的GMP級質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染步驟，過程還涉及質(zhì)粒制備（圖2）。因此，除了工藝引入的非特異性核酸酶中存在的宿主DNA殘留外，還需嚴(yán)格控制質(zhì)粒E.coli宿主細(xì)胞殘留DNA、RNA和殘留蛋白。
圖2 基因治療用病毒載體生產(chǎn)流程[2]
需要特別注意的是，F(xiàn)DA提醒使用HEK293T細(xì)胞生產(chǎn)病毒載體時因存在SV40 T抗原，還需要檢測殘留的腺病毒E1（E1A & E1B）和SV40 T抗原序列。《中國藥典》有關(guān)生物制品宿主殘留核酸質(zhì)量控制要求和CDE頒布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品申請臨床試驗藥學(xué)研究和申報資料的考慮要點(diǎn)》中關(guān)于質(zhì)粒和病毒載體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也提到，如使用HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)，需進(jìn)行宿主DNA和RNA殘留、SV40大T抗原DNA殘留、E1A和E1B基因DNA殘留檢測。
圖3 六種 HEK293 細(xì)胞系的譜系關(guān)系示意圖[1]
劃重點(diǎn)：
?非特異性核酸酶廣泛應(yīng)用于病毒載體生產(chǎn)中的核酸殘留消解；
?對病毒載體生產(chǎn)過程中相關(guān)DNA需要全面檢測分析，包括病毒載體包裝生產(chǎn)所用的細(xì)胞系HCD，特定細(xì)胞系所攜帶的風(fēng)險基因，以及HCD的片段分布；
?高品質(zhì)全面的HCD及風(fēng)險基因DNA檢測試劑盒使得核酸酶處理工藝的優(yōu)化保證了穩(wěn)定的殘留核酸清除和高質(zhì)量的病毒載體。
湖州申科基于基因治療用病毒載體生產(chǎn)相關(guān)質(zhì)控風(fēng)險，研發(fā)了一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的宿主細(xì)胞DNA殘留量及片段分析檢測試劑盒、HEK293細(xì)胞系HCD和相關(guān)風(fēng)險基因檢測試劑盒，以及非特異性核酸酶殘留檢測試劑盒等，能夠快速檢測基因治療產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)過程的中間品、半成品和成品中核酸和由此引入的工藝雜質(zhì)殘留。
HEK293細(xì)胞系殘留DNA檢測及風(fēng)險基因檢測
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
| 1101104 | HEK293殘留DNA檢測試劑盒 |
| 1201202 | 293T總RNA殘留檢測試劑盒 |
| SK030213SV100 | SV40LTA & E1A殘留DNA檢測試劑盒 |
| 1101109 | E1A殘留DNA檢測試劑盒 |
| 1101110 | E1B殘留DNA檢測試劑盒 |
宿主細(xì)胞殘留DNA/RNA檢測
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
| SK030207H100 | Human 殘留 DNA 檢測試劑盒 |
| SK030202E100 | E.coli 殘留 DNA 檢測試劑盒 |
| 1201201 | E.coli 總RNA殘留檢測試劑盒 |
| SK030217PL100 | 質(zhì)粒 DNA殘留檢測試劑盒 |
| SK030204V100 | Vero 殘留 DNA 檢測試劑盒 |
宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析檢測
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
| 1103171-2 | E.coli殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103170-2 | CHO殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103173 | Human殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103174 | Vero殘留DNA片段分析檢測試劑盒（2G） |
| 1103175 | MDCK殘留DNA片段分析檢測試劑盒 |
湖州申科作為生物制藥質(zhì)量分析專用試劑的國內(nèi)主要供應(yīng)商，核心產(chǎn)品在FDA備案了DMF，多項發(fā)明專利應(yīng)用于藥品法規(guī)的技術(shù)通則，成功支持多家客戶進(jìn)行中、美、歐的IND及BLA申報。
參考文獻(xiàn)：
[1] Magdalena Malm.Evolution from adherent to suspension:systems biology of HEK293 cell line development [J].Scientifc Reports,(2020) 10:18996
[2] Jane F. Barlow.Insights on Successful Gene Therapy Manufacturing and Commercialization[EB/OL].https://go.pall.com/genetherapyebook.html,2021-1-12