宿主細胞蛋白（host cell proteins, HCPs）是生物制品基于細胞基質生產工藝而帶入的一種多蛋白質混合物，部分HCPs會影響藥物的安全性和有效性。因此，HCP殘留檢測是生物藥關鍵質量屬性之一。國內外的藥典法規要求可采用高檢測靈敏度和良好特異性的酶聯免疫吸附法（ELISA法）進行HCP定量檢測。
USP<1132> 和EP<2.6.34>建議對于即將進入商業化生產的（臨床III期及以后）或生產工藝穩定的生物制品采用定制化ELISA試劑盒進行HCP檢測，同時USP<1132>中較為詳細地介紹了HCP ELISA試劑盒開發的流程，主要包含HCP抗原及校準品的制備、抗體的制備以及檢測體系的開發與驗證。為確保所開發檢測試劑盒的良好性能，法規對開發過程中各環節均提出了明確的要求。
圖1 定制化HCP ELISA試劑盒開發流程和關鍵點
一、抗原具備代表性，校準品賦值準確，溯源清晰
HCP ELISA定制化檢測試劑盒，通常使用空細胞或空載細胞模擬實際生產工藝進行生產，根據實際工藝收獲制備相應的抗原。因此，法規要求采用2D-SDS/PAGE或LC-MS等多種方法對抗原和實際生產工藝中所產生HCPs進行深入分析，確保所選擇的作為抗原的HCPs可以充分覆蓋實際生產工藝中的HCPs的種類，保證抗原與實際殘留的HCPs的代表性。
圖2 采用2D-SDS/PAGE法表征抗原的HCPs代表性：模擬工藝抗原2D電泳銀染圖譜，蛋白點數591；實際工藝HCPs 2D電泳銀染圖譜，蛋白點數：574
圖3.采用LC/MS法表征抗原的HCPs代表性：模擬工藝抗原LC-MS方法分析，蛋白數1688；實際工藝抗原LC-MS方法分析，蛋白數：1560（A：實際工藝樣品特有蛋白數；B：模擬工藝樣品特有蛋白數；C：二者共同蛋白數）
# 抗原選擇
以CHO宿主表達抗體或重組蛋白來講，一般是收獲空載細胞上清收獲液，對其進行離心或膜包過濾，濃縮換液處理，再進行校準品制備和動物免疫。
校準品作為關鍵原材料，其良好的穩定性和溯源保障對生命周期至關重要。為確保校準品的穩定，一般采用凍干工藝制備校準品，用單因素方差分析方法對校準品進行均一性評估，采用法規規定的蛋白定量方法進行校準品的賦值，并溯源至國家標準品（如有）或BSA國家標準品。
圖4 HCP校準品溯源鏈
二、抗體性能優異，覆蓋率高，批量大
動物免疫前，通常需要確認待免疫動物的血清對目標產品蛋白是否有交叉反應。由于HCPs是復雜的多分析物，為制備盡可能高覆蓋率的抗體，覆蓋工藝下特有的高風險HCPs，需采用可靠的免疫策略。免疫過程中，進行血清和效價的檢測；收獲血清后，可采用ProteinG純化的方法，并對抗體進行性能表征，確?？贵w的濃度、純度、效價等指標滿足檢測要求。
得到符合性能要求的抗體后，需采用經過驗證的可靠的2D或LC-MS方法進行抗體覆蓋率的表征，以確?？贵w可以充分覆蓋各實際工藝下產生的HCPs。
圖5 LC-MS HCP抗體覆蓋率分析圖
三、檢測體系穩健，方法驗證合規，供應穩定
得到了具有代表性的抗原和性能優良的抗體后，便是ELISA檢測體系的開發，主要包括原輔料的篩選和制備研究、各組分工藝及反應體系研究、穩定性研究等。
為達到最優的抗體固相化效率，同時兼顧檢測靈敏度和包被一致性，抗體包被過程需要優化抗體的濃度、配比，緩沖液的離子強度及pH，反應過程的溫度與時間，封閉方法，洗滌與干燥等工藝參數。此外還需要進行包被過程中使用的試劑、耗材等原輔料的測試評估。同時，為達到良好的檢測靈敏度及檢測特異性，抗體標記過程需要在維持抗體構象穩定的前提下，選擇兼容性較好的標記物進行標記，并且對偶聯方法進行優化評估。
檢測體系開發完成后，需要根據ICH及藥典要求進行分析方法驗證的評估，以確保整個檢測體系的線性、范圍、檢測限、定量限、準確度、精密度、專屬性以及耐用性等可以滿足法規要求。另外，抗體預包被的酶標板、校準品、標記后的抗體、試劑盒等還需進行充分的穩定性評估（如長期穩定性、加速穩定性...），同時需要穩定的生產工藝以確保定制化試劑盒可以滿足長期穩定的供應。
表1 定制化HCP ELISA試劑盒標曲性能
表2 定制化HCP ELISA試劑盒批內批間精密度
綜上所述，HCP ELISA定制化開發平臺需要具備完善的開發體系，可靠的技術平臺，專業的開發團隊，以實現長期穩定供應符合法規要求的試劑盒。
湖州申科在HCP ELISA檢測技術領域深耕多年，已建立高質量的技術先進的HCP ELISA試劑盒全流程自有開發平臺，涵蓋抗原表征/制備、動物免疫、抗體制備、體系開發及驗證平臺，確保輸出的HCP ELISA檢測試劑盒性能滿足用戶申報需求，已服務國內外200+家生物醫藥企業。
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