圖1：樣本制備流程。

A. 組織保存：石蠟包埋(FFPE)和冷凍保存；

B. 根據最終應用，組織塊切成不同厚度的切片；

C. 在二甲苯、梯度酒精中進行脫蠟和水化；

D. 熱誘導抗原修復；

E. PAP筆在組織切片周圍畫圈施加疏水屏障，將試劑限制在特定范圍內。

*脫蠟和水化僅適用于FFPE組織切片；

**對于解剖后速凍的組織，可能不需要熱誘導 抗原修復；無論后續選擇石蠟包埋還是冷凍保存，經過福爾馬林固定的標本進行抗原修復都能改善染色。

組織樣本的長期保存主要分為2類：石蠟包埋和冷凍保存

石蠟包埋：?.醛類固定; ?.梯度酒精脫水; ?.二甲苯透明; ?.石蠟浸透。

經由福爾馬林固定( 防止組織自溶和腐?。槐４娼M織形態)；接著，固定的組織經過一系列從低濃度到高濃度的梯度酒精處理；然后，與有機溶劑(如二甲苯)孵育去除酒精；最后一步，使用溫熱的石蠟浸透組織，然后冷卻硬化，形成福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊(FFPE)。

冷凍保存：將生物樣本在-20℃或-80℃下冷凍，是保存組織用于IHC應用的另一種選擇。常規冷凍流程：新鮮組織在液氮、異戊烷或干冰中速凍，用OCT包埋，再用冷凍切片機切片。組織固定通常在切片后進行，固定劑可選擇丙酮、甲醇、乙醇和甲醛等。

固定劑選擇tips(左圖)	石蠟包埋和冷凍保存流程圖(右圖)

快速冷凍樣本是保持組織和細胞形態的關鍵。如果冷凍速度過慢，會導致大冰晶的形成，從而破壞形態結構。下面是兩種快速冷凍樣本的方法：

?. 在一個盛有液氮的小型杜瓦瓶中，放入一個裝有異戊烷的金屬容器。用鋁箔紙包裹組織，然后將其浸入冰冷的異戊烷中。

?. 將干冰粉碎并放入一個小型聚苯乙烯泡沫盒(泡沫箱)中。將組織放入盒中，并用粉碎后的干冰將其覆蓋。

組織經冷凍或石蠟包埋后，需分別使用冰凍切片機或石蠟切片機進行切片。切片的常規厚度需根據最終實驗目的而定。FFPE蠟塊和冷凍組織都適用于制備薄切片和厚切片；但在需要超薄切片(<6μm)的應用中，FFPE蠟塊的切片效果通常優于冷凍組織。研究人員可針對不同實驗目的嘗試多種切片厚度，以確定最佳條件。

薄切片：需要高顯微鏡分辨率，且視野內僅需觀察少量細胞時，薄切片是首選；

厚切片(>6μm)：研究腦組織3D形態或神經軸突通路時，可選擇>6μm的厚切片；

超厚切片(20–40μm)：適合細胞體視學定量分析和漂浮切片實驗；

注：較厚的切片可能需要在后續流程中進行更長時間的孵育；厚冷凍切片可在封閉步驟中加入去污劑以提高組織通透性。

切片完成后，載玻片需要在室溫下自然晾干約24小時，或者在50-60℃的烘箱中烘干1小時，在烘箱中烘干時必須密切留意，因為在高溫下長時間烤片可能會降低免疫原性。有些組織還可以放在50℃恒溫烤片機上加熱30-60分鐘，這樣可以避免樣本從載玻片上脫落。使用化學粘附試劑(如VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion，貨號SP-1800)，有助于組織在原位雜交、高溫抗原修復等嚴苛條件下仍牢固附著在載玻片上。

FFPE樣本切片后需進行脫蠟和水化。這個過程的順序(圖2)與石蠟浸透時的脫水步驟完全相反：

?. 二甲苯脫蠟

?. 梯度酒精復水

圖2. 脫蠟、復水步驟簡易圖

脫蠟不徹底會導致同一樣本中同一 抗原染色出現不均勻或呈斑片狀，使用新鮮配制的試劑是避免這一問題的措施之一。另外，載玻片在每種溶液中浸泡的時間必須適當，且切片越厚所需時間越長；例如，4-5μm的切片完全脫蠟，至少需要2次二甲苯浸泡，每次5分鐘；更厚的切片可延長時間或增加次數。

福爾馬林固定會使組織蛋白質的氨基酸之間形成交聯。雖然這一過程對于硬化組織和維持形態至關重要，但該過程也會掩蓋抗原表位、降低抗原性，導致染色弱或無染色?？乖迯筒襟E可幫助恢復被掩蓋的表位，從而獲得最佳的染色效果。

熱誘導抗原修復(HIER)：即在特定緩沖液中加熱組織以破壞交聯(圖3)，相比于酶解法具有明顯的優勢?？蛇x擇的加熱設備有微波爐、高壓鍋、水浴鍋或高壓滅菌器，高壓鍋和高壓滅菌器可以在不發生劇烈沸騰的情況下將樣本加熱至100℃以上，微波爐也具備這個優勢，且專業的實驗室型號可以控制溫度，但需要密切監控，并隨時補充蒸發掉的緩沖液。水浴鍋也能控制溫度，并允許在較低溫度下進行熱誘導抗原修復，這可能非常適合某些特定的應用。無論選擇哪種設備，都需要確定理想的溫度(如果設備允許)和孵育時間。一般的建議是：從低溫開始，根據需要逐漸升高，并在組織出現損傷跡象之前停止。

溫度對抗原修復效果的影響比緩沖液的選擇更為顯著，緩沖液的pH值同樣重要，檸檬酸鹽和Tris體系溶液是最常用的選擇。選擇修復緩沖液時，可以優先參考抗體說明書，無說明書時需自行測試決定。

圖3. 熱誘導抗原修復原理圖

樣本制備的最后一步：使用PAP筆在切片周圍畫疏水屏障圈，能將試劑限制在特定區域內，避免同張載玻片上多種試劑混合。與傳統PAP筆相比，ImmEdge® PAP筆(貨號H-4000)具備以下特點：

?. 適用于含或不含去污劑(Tween 20、Triton X-100等)的緩沖液，屏障穩定

?. 淺藍色疏水圈，清晰可見，兼容酶法與熒光檢測系統

?. 可溶于各類常用透明劑(如二甲苯等)，方便清理

?. 環保：不含《蒙特利爾議定書》及歐盟理事會認定的破壞臭氧層的物質

規范的樣本制作，不僅是染色成功的基石，更是確保鏡檢過程順暢無憂的關鍵。每一步選擇都必須貼合實驗需求，任何環節操作不當都可能影響結果。唯有前瞻性的全盤考量、科學的決策以及全程使用優質試劑，方能確保實驗圓滿成功。

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