原因分析

解決方法

樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。

添加蛋白酶抑制劑。

目標蛋白濃度過低（低于檢測下線）。

加大上樣量或提高目標蛋白濃度。

轉膜時間太短導致目標蛋白沒有充分轉移到膜上，或者轉膜時間過長導致樣品轉穿。

控制轉膜時間并選擇適合的轉印膜。

一抗的特異性不佳，導致一抗無法識別目標蛋白。

選用高品質抗體。

一抗反復使用后導致效價降低，盡管還能與目標蛋白連接，但連接蛋白的數量太少。

一抗不宜反復使用。

洗脫過渡導致與一抗相結合的目標蛋白被洗掉。

洗脫時間的時間和頻率應有效控制，一般建議3次10分鐘。

原因分析

解決方法

一抗濃度太高，導致抗體非特異性結合。

降低一抗濃度。

洗膜的時間和次數不夠，導致其他蛋白沒有清洗干凈。

提高洗脫時間和頻率。

封閉物用量不足。

提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜。

封閉物使用不當。

檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉。

封閉時間不夠。

室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜。

一抗稀釋度不適宜。

對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。

一抗孵育的溫度偏高。

建議4℃結合過夜。

原因分析

解決方法

膜上其他部位與一抗或二抗非特異性結合，配置的封閉液可能沒有完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導致發光時候膜上形成黑點。

配置封閉液后最好靜止一下，封閉牛奶一定要純，封閉結束之前要清洗三遍之后再加一抗。

抗體與封閉試劑反應。

使用前過濾封閉試劑。

HRP 偶聯二抗中有聚集體。

過濾二抗試劑，去除聚集體。

原因分析

解決方法

一抗非特異性與蛋白結合，此種情況大多數情況是因為一抗特異性不好。

更換一抗。

目的蛋白有多個修飾位點，有些一抗還能結合其他蛋白的結合位點。

更換一抗品種。

蛋白樣品降解，蛋白酶將目標蛋白分解成若干個蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識別。

添加蛋白酶抑制劑。

原因分析

解決方法

過高的蛋白上樣量或一抗和二抗濃度過高都會促使底物過快的消耗，導致我們在做化學發光檢測時，發光底物已經消耗殆盡而形成空斑。

減少蛋白上樣量、稀釋一抗和二抗的濃度。

原因分析

解決方法

膠體中存在氣泡，或不溶性雜質，膠不均不平整。

配膠時用的小燒杯，水，SDS，tris等等干凈無雜質。貼邊角加入液體，凝固時避免大幅度動作觸碰。

原因分析

解決方法

出現啞鈴裝條帶的問題，最大的可能性就是膠沒有配置好，膠凝固后不均一。另外還有一種可能就是樣品中含有太多雜質，沒有離心下來，然后雜質沉淀在孔的中間，蛋白被擠到兩邊。

把膠配好，不合格的膠堅決不能用。