Western Blot雖是實驗室最常用的蛋白分析技術，但是由于它步驟繁瑣、操作流程長、影響因素多，所以，導致我們在做實驗時會遇到各式各樣的問題。今天我們總結了一些WB實驗中經常遇到的各種“奇葩”條帶問題，并為你推薦了常用的解決方法，希望對大家有所幫助。
一、 目標條帶沒有信號
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原因分析 |
解決方法 |
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樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。 |
添加蛋白酶抑制劑。 |
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目標蛋白濃度過低（低于檢測下線）。 |
加大上樣量或提高目標蛋白濃度。 |
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轉膜時間太短導致目標蛋白沒有充分轉移到膜上，或者轉膜時間過長導致樣品轉穿。 |
控制轉膜時間并選擇適合的轉印膜。 |
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一抗的特異性不佳，導致一抗無法識別目標蛋白。 |
選用高品質抗體。 |
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一抗反復使用后導致效價降低，盡管還能與目標蛋白連接，但連接蛋白的數量太少。 |
一抗不宜反復使用。 |
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洗脫過渡導致與一抗相結合的目標蛋白被洗掉。 |
洗脫時間的時間和頻率應有效控制，一般建議3次10分鐘。 |
二. 圖片背景過高，難以分辨條帶
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原因分析 |
解決方法 |
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一抗濃度太高，導致抗體非特異性結合。 |
降低一抗濃度。 |
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洗膜的時間和次數不夠，導致其他蛋白沒有清洗干凈。 |
提高洗脫時間和頻率。 |
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封閉物用量不足。 |
提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜。 |
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封閉物使用不當。 |
檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉。 |
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封閉時間不夠。 |
室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜。 |
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一抗稀釋度不適宜。 |
對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。 |
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一抗孵育的溫度偏高。 |
建議4℃結合過夜。 |
三、 膜上出現黑點和黑斑
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原因分析 |
解決方法 |
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膜上其他部位與一抗或二抗非特異性結合，配置的封閉液可能沒有完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導致發光時候膜上形成黑點。 |
配置封閉液后最好靜止一下，封閉牛奶一定要純，封閉結束之前要清洗三遍之后再加一抗。 |
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抗體與封閉試劑反應。 |
使用前過濾封閉試劑。 |
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HRP 偶聯二抗中有聚集體。 |
過濾二抗試劑，去除聚集體。 |
四、 出現非特異性條帶
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原因分析 |
解決方法 |
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一抗非特異性與蛋白結合，此種情況大多數情況是因為一抗特異性不好。 |
更換一抗。 |
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目的蛋白有多個修飾位點，有些一抗還能結合其他蛋白的結合位點。 |
更換一抗品種。 |
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蛋白樣品降解，蛋白酶將目標蛋白分解成若干個蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識別。 |
添加蛋白酶抑制劑。 |
五、條帶中出現整條白色空斑
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原因分析 |
解決方法 |
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過高的蛋白上樣量或一抗和二抗濃度過高都會促使底物過快的消耗，導致我們在做化學發光檢測時，發光底物已經消耗殆盡而形成空斑。 |
減少蛋白上樣量、稀釋一抗和二抗的濃度。 |
六、條帶中出現白圈
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原因分析 |
解決方法 |
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轉膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉膜時氣泡。 |
制作“三明治”時，注意趕走氣泡。通常將電轉液倒入一個盤子里，液體高度與第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆一些轉膜液，把電泳膠用清水清洗后平鋪在濾紙上，隨后在確認濾紙與膠之間無氣泡后，再往膠上澆一些電轉液，之后用雙手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜兩側中間，使膜成U型，再將U型底部接觸到膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣可以減少氣泡。上層濾紙同樣用U型的放置方法，可以用玻璃棒貼實一下，然后蓋上海綿墊。 |
七、 條帶拖尾
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原因分析 |
解決方法 |
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這種情況很容易出現，因為導致條帶拖尾的原因很多，可能性較大的是一抗濃度太高，作用時間太長或蛋白量過大。 |
根據情況調整蛋白量，同時降低一抗的濃度，縮短一抗的時間。 |
八、條帶變形
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原因分析 |
解決方法 |
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膠體中存在氣泡，或不溶性雜質，膠不均不平整。 |
配膠時用的小燒杯，水，SDS，tris等等干凈無雜質。貼邊角加入液體，凝固時避免大幅度動作觸碰。 |
九、條帶呈啞鈴裝