免疫沉淀通用實驗方案
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一種基于抗原-抗體特異性結合的分子生物學技術，用于從復雜的生物樣本中選擇性地分離和富集目標蛋白質。這一技術的核心在于利用固相支持物（如磁珠或瓊脂糖樹脂）上的特異性抗體捕獲感興趣的蛋白質，隨后通過洗滌去除非特異性結合的雜質，最終釋放純化的抗原-抗體復合物以供下游分析。
免疫沉淀技術在蛋白質研究中的應用極為廣泛，包括但不限于蛋白質-蛋白質相互作用的研究、表位映射、翻譯后修飾分析以及基因調控研究。例如，通過免疫沉淀與質譜聯用，可以鑒定和表征細胞內的蛋白質復合體和相互作用網絡；而染色質免疫沉淀（ChIP）則用于研究蛋白質與DNA之間的相互作用，揭示染色質結構和基因表達調控的動態變化。
此外，免疫沉淀技術還可以與高通量篩選平臺整合，系統分析蛋白質相互作用網絡，識別新的蛋白質復合體，并揭示細胞過程和疾病背后的信號通路。
本實驗方案將針對細胞樣本，采用磁珠法介紹免疫沉淀通用實驗步驟。
第1階段 制備裂解物
第一步是在合適的緩沖液中裂解細胞或組織樣本，以將蛋白質釋放到溶液中。理想的裂解緩沖液將最大限度地減少蛋白質變性，同時從樣品中釋放足夠的蛋白質。
非離子型洗滌劑（如NP-40和Triton X-100）的刺激性小于離子型洗滌劑（如SDS 和脫氧膽酸鈉）。其他可能影響免疫沉淀成功的變量包括鹽濃度、二價陽離子濃度和pH值。
所需材料
- 合適的裂解緩沖液（例如：N274337）
- 蛋白酶抑制劑混合物（例如：P301903）
- 磷酸酶抑制劑混合物（可選-例如：P666104）
- PBS
實驗步驟
1.選擇合適的裂解緩沖液。
|
整個過程中將樣品、緩沖液和設備放在冰上。
2.在緩沖液中添加蛋白酶抑制劑，包括磷酸化蛋白質的磷酸酶抑制劑。
3.分離細胞并將其懸浮在裂解緩沖液中。一般建議1-3×107個細胞添加300 µL裂解緩沖液，3×107個以上細胞添加600 µL緩沖液。如果細胞不能很好地懸浮，可適當增加裂解緩沖液。
4.將細胞與裂解緩沖液在冰上孵育10分鐘（不攪拌）。然后將裂解物在冰水中超聲處理3次。
注意：該過程可能需要優化。如果細胞仍然聚集在一起，則需使用渦旋進行攪拌。
5.4°C下以8,000 × g的速度離心10分鐘，將上清液轉移到新管中，并置于冰上。
6.使用Bradford或BCA檢測法測定裂解物中的蛋白質濃度。
7.如果不立即使用，請將等分試樣快速冷凍在液氮中并儲存在-80°C下。
第2階段 免疫沉淀和清洗
免疫沉淀蛋白質主要有兩種方法。第一種方法是將抗體與裂解物混合，然后將 Protein A/G磁珠添加到抗體-裂解物復合物中。這種方法可獲得高純度的蛋白質；然而，抗體也會與目標蛋白質一起洗脫，這有時會給蛋白質印跡檢測帶來困難。
第二種方法是制備抗體-磁珠復合物，然后將其與裂解物一起孵育以提取目標蛋白質。這種方法的產量比第一種方法要低，但避免了抗體共洗脫的問題。
或者也可以按照以下方案進行IP。如果使用同型對照抗體，您可以采用相同的實驗操作，并在分析結果時將其與目標蛋白的IP進行比較。
所需材料
- 裂解物
- 一抗
- 同型對照抗體
- Protein A/G磁珠（例如：P8104、P8103）
- 磁力架
實驗步驟
1.將裂解物與抗體在4°C下孵育過夜，輕輕攪拌。
2.將Protein A/G磁珠添加到抗體-裂解物復合物中。一般每1 mL裂解物添加約100 µL磁珠。4°C下輕輕搖動孵育1-4小時。
注意：裂解物和珠子溶液的體積可能需要優化。
3.用PBS緩沖液清洗磁珠三次，以去除未結合的雜質。
3.1將管子放在磁力架上約1分鐘；磁珠應被磁鐵拉到管子底部。
3.2吸出并丟棄溶液，保留磁珠。
3.3向磁珠中添加約1 mL新鮮裂解緩沖液，并重復上述步驟。
這時，目標蛋白質應該與包被磁珠的抗體特異性結合。
第3階段 洗脫
洗脫可以在各種緩沖液條件下進行，包括甘氨酸（非變性）、Laemmli（變性）和尿素緩沖液。
在所有這些緩沖液中，含有SDS的Laemmli緩沖液是最嚴苛的，因為它會連同目標蛋白一起洗脫非共價結合的抗體和抗體片段。相比之下，甘氨酸緩沖液會溫和地洗脫蛋白，洗脫的抗體量會減少。
- 甘氨酸緩沖液（非變性）
所需材料
- 0.1-0.2 M 甘氨酸，pH 2.6
- 與磁珠結合的樣品
實驗步驟
1.將等體積的甘氨酸添加到磁珠中，室溫下孵育10分鐘，輕輕攪拌。低pH值會將目標蛋白質與抗體磁珠分離。
2.使用磁力架將磁珠與溶液分離。將管子放在磁力架上約1分鐘，使磁珠被磁鐵拉到管底部。
3.吸出溶液，保留磁珠，然后將該溶液轉移到新管中。
提示：（1）有需要的話，可以重復步驟 1-3幾次以最大限度地洗脫蛋白質。
（2）可以用裂解緩沖液清洗磁珠以去除甘氨酸，從而使磁珠可以重復使用。
4.加入Tris-HCl中和溶液的pH值。
注意：此時，如果不立即使用，則分裝樣品，快速冷凍，并儲存在-80°C下。
5.使用蛋白質印跡法或其他技術分析IP結果。如果有使用同種型抗體的話，可以將捕獲抗體和同型對照抗體所進行的 IP 結果進行比較。
- 變性緩沖液
所需材料
- 變性緩沖液：（例如：0.1 M DTT、1× LDS或任何其他緩沖液）
- 與磁珠結合的樣品
- 磁力架或微量離心機
實驗步驟
1.將等體積的變性緩沖液加入到珠子中，100°C下孵育5分鐘。高溫和緩沖液使抗體珠與目標蛋白質分離，同時使蛋白質變性。
2.使用磁力架將磁珠與溶液分離。將管子放在磁力架上約1分鐘，使磁珠被磁鐵拉到管底部。
3.吸出溶液，保留磁珠，然后將該溶液轉移到新管中。
注意：如果不立即使用，則分裝樣品，快速冷凍，并儲存在-80°C下。
4.用Western blot分析IP結果。如果有使用同種型抗體的話，可以將捕獲抗體和同型對照抗體所進行的IP結果進行比較。
如需了解更多產品詳情，請前往阿拉丁官網查詢。