固定免疫沉淀實驗方案
免疫沉淀實驗是生物化學和分子生物學中用于研究蛋白質相互作用和蛋白質表達狀態的重要技術。根據實驗的具體需求和條件，可以采用不同的免疫沉淀方法，主要包括磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。
磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠與特定抗體結合，進而捕獲目標蛋白。這種方法的特點在于操作簡便、快速，且分離效率高，特別適合高通量篩選和自動化實驗。磁珠通過磁性分離架進行快速分離，使得實驗步驟更加簡潔。此外，磁珠免疫沉淀法在研究蛋白質-蛋白質相互作用和信號傳導途徑時尤為有用。
固定免疫沉淀法則使用固定化的抗體（通常是抗體偶聯到珠子上）捕獲目標蛋白，通常用于蛋白質印跡法（Western Blot）分析前的樣品準備。這種方法需要更長的孵育時間來形成免疫復合物，但能提供高特異性和靈敏度的結果，適合于定量分析目標蛋白的表達和修飾狀態。固定免疫沉淀法在研究蛋白質表達水平、翻譯后修飾或蛋白質穩定性時尤為重要。
之前介紹過磁珠免疫沉淀法的具體操作，本文將針對固定免疫沉淀法的實驗操作進行具體描述。
所需溶液與試劑
（1）PBS緩沖液。
（2）1× 細胞裂解緩沖液：20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM焦磷酸鈉、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml亮抑酶肽。
（3）3× SDS樣品緩沖液：187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30%甘油，150 mM DTT，0.03% w/v溴酚藍。
注：以上溶液均用超純水制備。
細胞裂解液在使用前添加1 mM PMSF。
1.制備細胞裂解物
1.1吸干培養基。根據實驗目的，添加含有調節因子的新鮮培養基，對細胞處理一段時間。
1.2去除培養基，用冰預冷的PBS洗滌細胞一次。
1.3去除PBS，每塊細胞培養板（10 cm）添加0.5 ml預冷的1× 細胞裂解緩沖液和1 mM PMSF。
1.4置于冰上孵育5分鐘。
1.5從板上輕輕刮下細胞，轉移至微量離心管，置于冰上。
1.6在冰上對樣品超聲處理四次，每次5秒。
1.7在4°C下微量離心10分鐘，然后將上清液轉移到一根新的試管中。
1.8盡快進入下一步，如暫時不進行后續實驗，需將裂解物保存在-80°C。
2.免疫沉淀法
2.1取200 μl細胞裂解物，并添加10 µl固定抗體，置于搖床上輕輕搖動，在4°C下孵育過夜。
2.2于4°C條件下微量離心30秒。
2.3用500 µl的1×細胞裂解緩沖液，重懸沉淀物進行清洗，然后離心去除上清，共清洗五次。洗滌間期，保持樣品于冰上。
2.4使用20 μl 3× SDS樣品緩沖液重懸沉淀物。渦旋振蕩，然后再微量離心30秒。
2.5加熱樣品到95-100°C，并持續2-5分鐘。
2.6取15-30 µl樣品上樣到SDS-PAGE凝膠，進行蛋白質印跡實驗（請參閱蛋白質免疫印跡法實驗步驟）。
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