蛋白質印跡的二抗選擇指南
目標物種（一抗）
在選擇用于蛋白質印跡的二抗時，主要選擇標準之一是二抗所結合的一抗的物種。例如，如果一抗是兔多克隆IgG，則可以使用在另一個宿主物種（例如山羊、驢或小鼠）中產生的抗兔IgG二抗來檢測一抗（例如，山羊抗兔IgG二抗Ab176443）。
為了通過蛋白質印跡檢測多個特定蛋白質靶標，使用來自不同物種的一抗會很有幫助。然后可以使用標記有不同熒光染料（例如 Alexa Fluor Plus 488、555、647或680）的匹配二抗進行多重熒光蛋白質印跡。
我們提供多種標記二抗，適用于熒光或化學發光蛋白質印跡。從超過15種目標物種中選擇，找到與您的一抗相匹配的新二抗。
我們可以生成二抗以結合整個一抗免疫球蛋白，例如H+L（重鏈和輕鏈）靶向二抗，或者可以生成二抗以僅結合免疫球蛋白的特定部分，例如kappa與lambda 輕鏈特異性二抗、重鏈與輕鏈特異性二抗或片段特異性二抗。例如Fc片段特異性二抗、F(ab) 或 F(ab')2 特異性二抗。
在規劃蛋白質印跡實驗時，除了優化抗體稀釋度等其他因素外，二抗的選擇也有助于獲得最佳結果。精心選擇二抗并優化稀釋度可以顯著改善蛋白質印跡分析，尤其是在處理同一蛋白質印跡膜上不同豐度的蛋白質靶標或高親和力與低親和力的一抗時。
靶標豐度變化非常常見，因為上樣對照管家蛋白在裂解物中非常豐富，而許多目標蛋白靶標可能僅以低拷貝數表達。在同一膜上同時可視化兩者可能具有挑戰性。下表提供了一般準則，可幫助利用不同二抗的獨特功能來改善蛋白質印跡檢測。
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二抗靶點 |
優點缺點? |
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H+L鏈特異性：多種二抗與一抗的重鏈和所有免疫球蛋白的輕鏈結合 |
優點： （1）最通用的選擇?？贵w可與重鏈和輕鏈結合，而不受一抗結構影響。 （2）推薦用于化學發光和熒光蛋白質印跡法中蛋白質靶標的高信號放大。 （3）利用交叉吸附或高度交叉吸附的抗體獲得高靈敏度和低背景。 缺點： （1）高豐度靶標檢測可能導致高抗體濃度下線性檢測范圍之外的信號飽和。 （2）建議使用交叉吸附或高度交叉吸附的H+L二抗，以最大限度地減少與樣品中IgG結合蛋白的交叉反應。 （3）可能與其他免疫球蛋白的輕鏈發生交叉反應。例如，所有山羊抗兔 IgG（H+L）二抗不僅會與兔IgG重鏈（γ鏈）結合，還會與所有兔免疫球蛋白（如IgM、IgE 或IgA）的輕鏈結合。 |
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Fc片段特異性：二抗與重鏈的 Fc 部分結合 |
優點： （1）是檢測小鼠單克隆一抗的良好選擇，結合不依賴于輕鏈特異性。 （2）當一抗靶標在~25 kD處時，可在免疫沉淀后用于結合天然一抗IgG。Fc特異性二抗僅檢測變性IgG的50 kD重鏈，而不結合25 kD輕鏈。 （3）可用于檢測重鏈Fc部分不同的特定免疫球蛋白同型和亞類。此特性使得使用不同同型和亞類的一抗在熒光 WB中進行多重檢測成為可能。 （4）Fc片段特異性二抗用途廣泛，因為它們也可用作免疫測定中的捕獲或檢測抗體。 缺點： （1）通常比H+L特異性二抗靈敏度更低。 （2）免疫細胞樣本中的Fc受體可能造成干擾。 （3）在免疫沉淀后使用時，Fc特異性二抗會結合天然一抗IgG以及變性IgG的50 kD重鏈。如果一抗蛋白靶標在~50 kD處運行，這可能會干擾靶標檢測。 |
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F(ab) 或 F(ab')2 特異性 二抗與一抗的 F(ab) 或 F(ab')2 部分結合，檢測重鏈或輕鏈 |
F(ab)和F(ab')2 特異性二抗在蛋白質印跡法中并不常用，因為大多數用于蛋白質印跡法的一抗都由重鏈和輕鏈組成。一抗Fc區的作用是為免疫球蛋白上的二抗結合提供額外的空間，從而實現更靈敏的靶標檢測。 |
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輕鏈特異性 |
優點： （1）結合與重鏈特異性無關。二抗將與所有具有相同輕鏈的免疫球蛋白類別和同種型結合。 （2）當檢測已知輕鏈組成的一抗時，可以使用Kappa鏈與 Lambda鏈特異性的二抗來獲得額外的特異性。 （3）當一抗靶標在~50 kD處時，可在免疫沉淀后用于結合天然一抗IgG。輕鏈特異性二抗僅檢測變性IgG的 25 kD 輕鏈，而不結合50 kD重鏈。 缺點： （1）通常比H+L特異性二抗靈敏度更低。 （2）在免疫沉淀后使用時，輕鏈特異性二抗會結合天然一抗IgG以及變性 IgG的25 kD輕鏈。如果一抗蛋白靶標在 ~25 kD處運行，這可能會干擾靶標檢測。 |
宿主物種和二抗類型（多克隆、單克隆、重組）
多克隆、單克隆和重組二抗以及抗體片段均可用于蛋白質印跡法。
多克隆二抗是目前使用最廣泛的二抗形式。它們可識別一抗上的多個表位，因此比僅識別一個表位或沒有Fc區的抗體片段的單克隆抗體更靈敏。
單克隆二抗的價值在于其批次間一致性，并且在許多情況下具有廣泛的特性和出版歷史。
重組二抗還有其他優勢。除了具有良好的特性和批次間一致性外，它們還可以在特定位點進一步修飾，以向天然免疫球蛋白添加所需特性，例如類別轉換或位點特異性標記。重組抗體可以匯集起來以生成重組抗體池，例如重組多克隆一抗或超克隆重組二抗。
下表顯示了多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體作為二抗的優缺點。
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多克隆 |
單克隆 |
重組 |
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定義 |
收集來自不同B細胞的二抗，這些二抗可識別同一免疫球蛋白上的多個表位。可特異性針對免疫球蛋白的任何部分，例如 Fc 或 F(ab)。最常用于生成檢測 H+L鏈的二抗。 |
由相同B細胞克隆產生的單一抗體，可識別同一免疫球蛋白抗原上的一個表位。它們可特異性針對kappa、lambda 輕鏈以及同種型和亞類。 |
源自重組DNA的單一抗體?？稍贒NA水平上進行修飾或用于生成確定的抗體池。 |
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優點 |
靈敏度高。多克隆抗體庫中的許多抗體可以與一抗上的表位結合。 |
批次間一致性。通常具有良好的表征、特定克隆的來源背景。 |
穩定、長期供應、批次間一致性?？尚薷臑樗杼匦砸蕴岣咝阅?。 |
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缺點 |
批次間差異是可能的，但通常不如一抗那么嚴重。 |
檢測靈敏度取決于單個表位的豐度和暴露程度。細胞系漂移可能導致抗體發生細微的長期變化。 |
非常專業且依賴表位。開發時間較長?？赡苄枰嗲捌趦灮?。通常價格較高。 |
檢測方法
二抗可以與幾種不同的探針或酶結合，以檢測靶抗原。標記的選擇取決于應用和二抗的檢測方式。酶報告基因，如辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP） 是蛋白質印跡中最常用的。這些酶可以與化學發光或顯色檢測方法一起使用。熒光標記的二抗也越來越廣泛地用于檢測低豐度靶標，信噪比也越來越高。
交叉吸附抗體
進行多重蛋白質印跡分析時，請考慮使用高度交叉吸附的二抗來限制抗體之間的交叉反應。交叉吸附是一種純化過程，有助于消除抗體混合物中的非特異性抗體，例如特定類別、同種型或宿主物種的抗體。
免疫沉淀后WB分析
在免疫沉淀后進行蛋白質印跡分析時，二抗選擇起著重要作用。進行免疫沉淀時，一抗或對照IgG通常與目標蛋白一起洗脫。因此，用于蛋白質印跡分析的洗脫部分始終含有不同量的IgG。例如，如果使用兔多克隆抗體通過免疫沉淀富集目標蛋白，則當使用傳統的HRP偶聯抗兔 IgG（H+L）二抗時，洗脫部分中還原和變性的重鏈和輕鏈將在25和50 kD處產生條帶，因為二抗直接與變性的IgG結合。
如果二抗產生的重鏈和輕鏈不會干擾一抗的目標靶標，則只需將這些條帶標記為重鏈和輕鏈。然而，當目標靶標可能在約25或50 kD處運行時，可能無法將目標條帶與重鏈或輕鏈條帶區分開來。
有幾種可以采用的解決方案：
•使用Clean-Blot IP檢測試劑，該試劑僅檢測天然一抗，而不檢測免疫沉淀洗脫級分中的變性IgG。
•如果目標靶點為~25 kD（輕鏈干擾），則使用Fc特異性二抗。
•如果目標蛋白分子量約為50 kD（重鏈干擾），則使用輕鏈特異性二抗。
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